毕业论文--异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶分离提纯及酶性质的研究

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1、异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶分离提纯及酶性质的研究辛国华1,鱼红闪2,金凤燮3（1.生物工程学院，11108220302322）摘要:本文主要对微生物Absidiasp.R9g所产的异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶进行分离提纯及其酶性质研究。研究表明该酶能水解异槲皮苷的β-葡萄糖基，得到槲皮素。该酶蛋白的分子量约为50kDa,酶反应的最适温度为50℃，最适pH为5.0，在温度60℃以下，pH3.0-7.0范围内酶活力较稳定，酶反应动力学研究，得到最大反应速度Vmax=3.2619mmol/L·h，米氏常数Km=57.6352mmol/L。关键词:异

2、皮槲苷-β-葡萄糖苷酶；槲皮素；酶反应特性中图分类号：Q556+.2PurificationandCharacterizationofIsoquercitrin-β–glucosidase（XINGuo-hua1，YUHong-shan2，JINFeng-xie3）(1.SchoolofBiologicalEngineering,11108220302322)Abstract:Thispaperpresentstheseparationandthestudyofcharacterizationoftheisoquercitrin-β–g

3、lucosidasefrommicroorganismsAbsidiasp.R9g.Thisenzymecanhydrolyzetheβ-glucosidaseofisoquercitrintoproducethequercetin．Themolecularweightoftheenzymeisabout50kDa．Inthe enzymaticreaction,theoptimumtemperaturewas50℃,theoptimumpHwas5.0.ThisenzymewasstableatpH3.0~7.0,below60℃.T

4、heVmaxandKmforisoquercitrin-β-glucosidasewas3.2619mmol/L·hand57.6352mmol/L,respectively.KeyWords：Isoquercitrin-β-glucosidase；Quercetin；Enzymaticpropert0引言黄酮类化合物是一类低分子天然植物成分，在自然界中分布广泛，在许多植物和大型真菌中都能找到。近年来，随着越来越多的黄酮类物质被发现，人们逐渐开始对该类物质的应用价值进行研究。起初，人们对该类物质的认识局限在用做染料方面，渐渐的人们认识到

5、芦丁、槲皮素等黄酮类化合物的药理性质并将其应用于临床后发现部分黄酮类化合物有显著地生理及药理活性[1，2，3]。这些生理和药理特性使其广泛应用于食品、医药等领域。槲皮素是一种典型的黄酮类化合物，在抗癌、抗氧化、抗炎症、抗菌等方面都有显著作用[4-6]。槲皮素也是许多其他类黄酮苷的苷元，其中一些化合物具有更高效的生理活性，从而为相关黄酮类化合物的生产提供了原料。槲皮素在自然界中的分布虽然广泛，但是单纯的从植物提取所获得的总量远不能够满足我们现在的需求，而且人工提取所需成本也非常大。因此，人们开始研究通过人工合成的方法来获得有价值的天然产物

6、，其中主要包括化学合成法和生物合成法两大类，其中化学合成法有生产条件苛刻、副产物多、产率低等缺点[7-9]。所以生物合成法就成为了我们研究的重点。本文采用微生物酶法进行槲皮素的生产，主要对异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶进行分离提纯以及酶性质研究。1材料与方法1.1材料异槲皮苷、槲皮素样品来自于由美国sigma公司，菌种Absidiasp.R9g由大连工业大学生物工程学院菌种保藏所提供，薄层层析板(TLC)为德国Merck公司生产的硅胶板。1.2实验方法1.2.1粗酶液的制备本实验采用的液体培养基配方为：将3.0％的槐花浸出液与97.0％麦芽汁

7、浓度为5度的麦芽汁混合均匀。121℃下湿热灭菌。将Absidiasp.R9g接种于液体发酵培养基中，接种量为1~2环。然后将其置于恒温振荡器中，在30℃，160r/min的条件下培养菌体4~5d。将培养好的发酵液冷冻离心，去除菌体，所得的上清液即为发酵液。将发酵液在冰浴条件下盐析处理。再冷冻离心，弃去上清液，收集沉淀。沉淀用0.02MpH5.0的HAC-NaAC缓冲液溶解，透析除盐，再次离心取上清液，即为粗酶液，粗酶液于4℃条件下保存备用。1.2.2酶的分离纯化及分子量的测定将收集到的粗酶液通过凝胶SephadexG-100分子筛分离，

8、收集有酶活的分布收集管并将其合并；利用上述收集液进行第一次DEAE-CelluloseDE52柱，收集酶活相对集中峰值的分布收集管；再次进行二次DEAE-CelluloseDE52柱分离，得到纯度很高的目的