β半乳糖苷酶基因gzd的表达及密码子优化

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1、中山大学硕士学位论文β-半乳糖苷酶基因gzd的表达及密码子优化姓名：陈敏洁申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：刘玉焕20090608中山大学硕士学位论文p一半乳糖苷酶基因蒯的表达及密码子优化Itmol／min。基因gzd在大肠杆菌中表达量很低。通过软件分析发现，gzd中约有60％的密码子为大肠杆菌非偏好密码子。为了进一步提高gzd的表达量，本论文利用OE—PCR的基因拼接技术对gzd进行了密码子优化，成功获得了全部由大肠杆菌偏好密码子组成的基因gzd。但由于时间关系，密码子优化后的gzd表达研究目前仍在进行中。采用真核高

2、效表达系统一乳酸克鲁维酵母分泌表达系统研究了基因gzd的异源表达情况。SDS—PAGE电泳结果显示，gzd在乳酸克鲁维酵母中的表达量很低，推测可能是由于目的基因的密码子不是乳酸克鲁维酵母的偏好密码子所致。另外重组蛋白几乎没有酶活力，这可能与目的蛋白在乳酸克鲁维酵母中的糖基化有关。关键词：p．半乳糖苷酶，异源表达，酶学性质，密码子优化V中山大学硕士学位论文p一半乳糖苷酶基因gzd的表达及密码子优化TheExpressionandCodonOptimizationforthep—D—galactosidaseGenegzdMajo

3、r：Microbiology一一一Name：ChenMin-jieSupervisor：ProfessorLiuYu·-huanABSTRACTp—D-galactosidase(p·D—galactosidegalactohydrolase，EC3．2．1．23，alsoreferredtoaslactase)hydrolyzesdisaccharidelactosetoglucoseandgalactose．Itiswidelyexistedinvariousmicroorganismssuchasbacteria，fun

4、gi，andinintestinesofvariousanimals．LactaseWasmainlyusedfortheclinicaltreatmentof”lactoseintolerance”，andtheproductionoflow-lactosemilk，wheyandotherdair)，products．Inrecentyears，lactasehasgainedincreasingpopularityinfoodanddkl时industry．Inourpreviousstudy,wehadscreened

5、apsychrotolerantandalkalotolerantstrainPlanococcussp．L3，whichcandegradelactoseandclonedanovelB—galactosidasegenegzdbyconstructingitsgenomiclibrary．Inthisstudy,weamplifiedgenegzdbyPCR舶mtotalDNAofPlanococcussp．L3，andtheninserteditintofourdifferentprokaryoticexpression

6、vectorsincludingpQE一30，pET-32a,pET-41aandpET-44a,respectively．Finally,thesevectorsweretransferredintoEcoliBL21(DE3)stainrespectively．Theoptimalexpressionofgzdwasobtainedundertheconditionof37。C，fmalconcentrationofO．125mMIPTGandeighthoursofinductiontime．Theoptimumtemp

7、eratureofGzdWas46℃，Gzdlostitsenzymeactivitywhenincubatedfor2hoursin45—70。C．TheoptimumpHofGzdWas9．0，anditisstableVI中山大学硕士学位论文p-半乳糖苷酶基因g耐的表达及密码子优化overarangeofpH7．0．10．0．Whenfinalconcentrationsof10mMCa+and1mMMn2+wereadded，theenzymeactivitiesincreased71．9％and35．0％，respe

8、ctively．However,Cu+andzn2+hadstronginhibitioneffectontheenzymeactivityofGzd．TheKmand‰xvalueoftheenzymeforthesyntheticsubstrateo—nitropheny