密码子优化hpv16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染

《密码子优化hpv16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染【摘要】目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1L1IRESL2。方法:用PCR技术从988载体中获得L1IRESL2片段,将该片段克隆到pCRXLTOPO载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1L1IRESL2;通过水动力转染技术(hydrodynamicsbasedtransfection)和脂质体细胞转染法(liposomem

2、ediatedtransfectionofcells),检测衣壳基因的体内、外转录情况;重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化,用Westernblot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达。结果:酶切和测序结果表明真核共表达载体pcDNA3.1L1IRESL2构建正确。重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、293T细胞中均发生转录。重组质粒转染293T细胞后出现CPE（cytopathiceffect）现象,表明衣壳基因在细胞中已表达。Westernblot方法检测发现L1蛋白在293T细

3、胞中表达。结论:成功地构建了pcDNA3.1L1IRESL2共表达真核载体,为进一步研究HPV16感染机制奠定基础。【关键词】密码子优化衣壳基因共表达真核载体细胞转染　人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)属乳多空病毒科,具有上皮细胞嗜性。迄今为止,已分离到的基因型有100种以上［1,152］。根据各型病毒的潜在致病性可将HPV分为低危型和高危型两类,大量研究证实高危型中的16、18型与宫颈癌的发生密切相关,其中又以HPV16型最为常见。宫颈癌是全世界仅次于乳腺癌致妇女死亡

4、的第二大癌症,据报道全球每年大约有50万宫颈癌新发病例,约25万人死于该癌症［3］。因为乳头瘤病毒的增殖与上皮细胞的分化紧密相连,所以一直以来感染性乳头瘤病毒只能通过烦琐的器官培养（organotypiccultures）和小鼠异种移植（mousexenografts）途径获得,而用这两种方法很难获得足量的野生型或突变型HPV颗粒,这大大限制了乳头瘤病毒生物学许多方面的研究［4-6］。最近Pyeon［7］、Culp［8］采用假病毒技术建立了用于病毒培养的瞬时转染系统,该系统中每个细胞能产生大量有感染性的

5、病毒,病毒产生量是常规器官培养的1000倍之多。Pyeon的研究表明,该瞬时转染系统要求密码子优化的L1与L2基因必须同时转染细胞,而单独L1基因或L2基因都不会使该系统发挥作用。Pyeon采用的是pcDNAHPV16L1和pcDNAHPV16L2两种质粒进行共转染,而本研究中,我们构建的是密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体即pcDNA3.1L1IRESL2,通过连接子IRES实现了L1和L2基因在一个载体中的共表达,无需同时转染两个质粒,可大大简化实验操作。　　1材料和方法　　1.

6、1材料988质粒（德国科学家MartinMueller惠赠）,15pcDNA3.1(+)载体（本实验室库存）;细胞株:293T细胞（中国农业科学院哈尔滨兽研所惠赠）;LATaqDNA聚合酶和反转录试剂盒（购自fermentas公司）;质粒提取和胶回收试剂盒（购自AXYGEN公司）;TOPOXLPCR克隆试剂盒及LipofecamineTM2000（购自Invitrogen公司）;电转化感受态Top10菌（购自TaKaRa公司）;HPV16L1单克隆抗体(mAb)（购自上海吉泰新择生物科技有限公司）;

7、辣根过氧化物(HRP)标记的羊抗鼠IgG（购自北京博奥森生物技术有限公司）;其他试剂均为国产分析纯;昆明白雌性小鼠（6～8周龄,质量18～22g）购自新疆医科大学动物实验中心。　　1.2方法　　1.2.1引物设计根据pcDNA3.1(+)载体和德国科学家MartinMueller提供的密码子优化的HPV16L1、L2基因序列设计5条引物,具体序列见表1。　　表1引物设计（略）　　Tab1Primerdesign　　1.2.2密码子优化的pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒的构建构建策略:以98

8、8质粒为模板扩增L1IRESL2基因片段,15将该片段构建到pCRXLTOPO载体上,然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中。目的基因的获取:以988质粒为模板,以HPVHL1L2P1/HPVHL1L2P2为引物,在LADNA聚合酶作用下,94℃预变性5min,94℃变性45s,67℃退火45s,68℃延伸4.5min,共30个循环,68℃延伸30min,合成L1IRESL2基因。10g/L琼脂糖凝