密码子优化hpv16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染

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1、密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染【摘要】目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1L1IRESL2。方法:用PCR技术从988载体中获得L1IRESL2片段,将该片段克隆到pCRXLTOPO载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1L1IRESL2;通过水动力转染技术(hydrodynamicsbasedtransfection)和脂质体细胞转染法(liposomemediatedtr

2、ansfectionofcells),检测衣壳基因的体内、外转录情况;重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化,用artinMueller惠赠）,pcDNA3.1(+)载体（本实验室库存）;细胞株:293T细胞（中国农业科学院哈尔滨兽研所惠赠）;LATaqDNA聚合酶和反转录试剂盒（购自fermentas公司）;质粒提取和胶回收试剂盒（购自AXYGEN公司）;TOPOXLPCR克隆试剂盒及LipofecamineTM2000（购自Invitrogen公司）;电转化感受态Top10菌（购自TaKaRa公司）;HPV1

3、6L1单克隆抗体(mAb)（购自上海吉泰新择生物科技有限公司）;辣根过氧化物(HRP)标记的羊抗鼠IgG（购自北京博奥森生物技术有限公司）;其他试剂均为国产分析纯;昆明白雌性小鼠（6～8周龄,质量18～22g）购自新疆医科大学动物实验中心。　　1.2方法　　1.2.1引物设计根据pcDNA3.1(+)载体和德国科学家MartinMueller提供的密码子优化的HPV16L1、L2基因序列设计5条引物,具体序列见表1。　　表1引物设计（略）　　Tab1Primerdesign　　1.2.2密码子优化的pcDNA3.1L1

4、IRESL2重组质粒的构建构建策略:以988质粒为模板扩增L1IRESL2基因片段,将该片段构建到pCRXLTOPO载体上,然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中。目的基因的获取:以988质粒为模板,以HPVHL1L2P1/HPVHL1L2P2为引物,在LADNA聚合酶作用下,94℃预变性5min,94℃变性45s,67℃退火45s,68℃延伸4.5min,共30个循环,68℃延伸30min,合成L1IRESL2基因。10g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。pCRXL

5、TOPOL1IRESL2的构建:琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,切胶回收并纯化L1IRESL2片段。按照TOPOXLPCR克隆试剂盒说明书,构建pCRXLTOPOL1IRESL2。电泳检测EcoRI、XhoI和SfiI酶切产物。pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒的构建与鉴定:用EcoRI、XhoI和SfiI酶切pCRXLTOPOL1IRESL2质粒,回收纯化L1IRESL2片段。T4DNA连接酶连接L1IRESL2基因片段与双酶切后的pcDNA3.1载体,16

6、℃过夜。用电转化法转化感受态Top10菌株（电压2500V,电阻200Ω,电容25μF）,37℃摇床孵育1h后涂布含氨苄青霉素的LB选择平板,37℃过夜。次日随机挑取阳性菌落,碱裂解法小量提取质粒。EcoRI及XhoI双酶切,琼脂糖电泳鉴定正确后送往上海生工测序。　　1.2.3小鼠肝脏中pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒表达情况的检测将等量的空pCDNA3.1载体和pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒（均为10μg）分别溶于2.5mL灭菌生理盐水中。采用以流体力学为基础的大容量快速尾静脉注射法（hy

7、drodynamicsbasedtransfectionmethod,HD)在7s内注入小鼠尾静脉中［9,10］。每组2只小鼠,注射后8h处死,取肝脏,按照Invitrogentrizol说明书提取总RNA,按照fermentas公司反转录试剂盒要求合成cDNA。利用L1基因、L2基因特异性引物检测这两种基因在小鼠肝脏中的表达情况。　　1.2.4293T细胞中pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒表达情况的检测选取对数生长期的293T细胞进行转染实验,转染步骤按Invitrogen公司提供的293T转染细胞的实

8、验流程操作。空pCDNA3.1载体作为对照组,pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒为实验组。培养48h后,观察细胞形态变化并按照步骤1.2.3的方法提取RNA,检测L1基因、L2基因的表达情况。同时用TRIzol法提取细胞总蛋白,:DL15000+2000marker;1:PCRfragmentofL1I