构建pdcd5基因真核表达载体及电转染bgc823细胞的研究

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1、构建PDCD5基因真核表达载体及电转染BGC823细胞的研究[摘要]目的构建PDCD5基因真核表达载体，并电转染BGC823细胞，获得稳定转染细胞。方法设计合成PDCD5基因片段，将其插入经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3.1+表达载体，菌落PCR和基因测序进行鉴定。重组质粒电转染BGC823细胞，G418筛选数周后PCR鉴定稳定转染细胞。结果重组质粒经菌落PCR测序分析表明，PDCD5基因序列准确插入预期位置，且序列正确。重组质粒成功电转染BGC823细胞，并整合入细胞基因组DNA。结论成功构建了PDCD5基因真核表达载体，并整合进BGC823细胞基因组，为研究PDCD5基因的功能及

2、胃癌的基因治疗提供实验基础。中国6/vie　　[关键词]PDCD5基因；pcDNA3.1+表达载体；电转染；BGC823细胞系　　[中图分类号]R394[文献标识码]A[]1673-9701（2017）06-0033-03　　[Abstract]ObjectiveToconstructeukaryoticexpressionvectorofPDCD5geneandtransfectBGC823cellstoobtainstabletransfectedcells.MethodsThePDCD5genefragmentididPDCD5genesequencidsicDNA.Conclusion

3、TheeukaryoticexpressionvectorofPDCD5geneissuccessfullyconstructedandintegratedintoBGC823cellgenome，entalbasisforstudyingthefunctionofPDCD5geneandgenetherapyofgastriccancer.　　[Keymedcelldeath5，PDCD5）原名为TFAR19，由北京大学人类疾病基因中心从白血病细胞株TF-1细胞中克隆得到，具有促进多种细胞凋亡和抑制增殖的效应，其异常表达与多种肿瘤及自身免疫性疾病有相关性[1]。研究表明，PDCD5基因在胶质

4、瘤细胞[2]、前列腺癌细胞[3]、结肠癌[4]和胃癌[5]等多种恶性肿瘤组织中较正常组织表达水平下降，并且重组人PDCD5蛋白可以增强软骨肉瘤细胞[6]和肺癌细胞[7]等肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其5年生存率低于20%，是全球第二个癌症死亡相关的原因，而我国每年因胃癌死亡病例占全球人口的47.8%[8]。本研究以PDCD5基因和BGC823胃癌细胞为研究对象，构建pcDNA3.1+-PDCD5重组真核表达载体，电转染BGC823细胞，并筛选稳定转染细胞株，为进一步研究PDCD5基因的功能及进行胃癌的基因治疗奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　BGC823细

5、胞株和pcDNA3.1+质粒由齐齐哈尔大学生命科学与农林学院邵淑丽教授惠赠；DNA回收试剂盒及细胞基因组DNA提取试剂盒由武汉金开瑞生物技术有限责任公司提供；RPMI1640培养基干粉购于Gibco公司；胎牛血清、DNAMarker及各种工具酶购于上海生工；ECM830型电穿孔仪购于美国BTX公司。　　1.2方法　　1.2.1PDCD5基因和引物的合成PDCD5基因序列由NCBI数据库提供的资料确定，并在序列5’端和3’端分别添加EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点，序列全长383bp，连同pcDNA3.1+表达载体通用引物（pcDNA3.1-F：CTAGAGAACCCACTGCTTAC；pcD

6、NA3.1-R：TAGAAGGCACAGTCGAGG）均送交武汉金开瑞生物技术有限公司合成。实验时间为2015年6月～2016年6月。　　1.2.2重�M载体的构建将pcDNA3.1+载体用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切37℃、3h；80℃、20min。用EcoRⅠ单酶切质粒作比对，电泳回收线性载体片段。用T4DNA连接酶连接双酶切载体与PDCD5基因16℃，12h，反应体系中双酶切载体和PDCD5基因的摩尔比为1∶3。