密码子优化后的柞蚕溶菌酶基因在酵母中的表达及活性测定

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1、‘犬裡＂２？大漠ＤＡＬＩＡＮＵＮＩＶＥＲＳＴＹＯＦＴＩＥＣＨＮＯＬＯＧＹ工醒ｆｉＳＳ士孝位文ＭＡＳＴＥＲＡＬＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮＭ義密码子优化后的柞蚕溶菌酶基因在酵母中的表达及活性测定生物工程工程领域文嫩作者姓名指忌教肺李文利副教授２（Ｉ５６＿Ｉ答辩日期Ｌ＿＾专业学位硕士学位论文密码子优化后的作垂溶菌酶基因在酵母中的表达及活性测定ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄＡｎｔｈｅｒａｅａｐｅｒｎｙｉ

2、ｌｙｓｏｚｙｍｅｇｅｎｅｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ：刘真英作者姓名工程领域：牛物工程３１３１８０２７：学号指导教师：李文利副教授完成日期：２０１５年５月大理工大旁ＤａｌｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果一。与我同工作的同志对本研究

3、所做的贡献均巳在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：釣權賴■卿柳＿输＿１４／作者签名：糾＼Ｉ：日期：对年月士日大连理丁大学专业学位硕士学位论文摘要溶菌酶Ｌｓｏｚｅ－ｍ，又称为胞壁质酶或Ｎ乙醜胞壁质聚糖水解酶，是天然免疫的重（ｙｙ）一一要分子之－。它可以专性的作用于微生物的细胞壁，主要通过破坏肽聚糖中的Ｎ乙－ＮＡＧ乙酰胞壁酸ＮＡＭ之间的－４糖酰氨基葡糖胺（）和Ｎ（）Ｐ１苷键，从而使细胞壁内的不，溶性的黏多糖分解成为可溶性的糖肽，进而致使细胞壁破裂或溶解，内容物逸出从而达

4、到抑制菌体生长或杀灭菌体的作用。因此，溶菌酶在大多数生物体生物防御方面具有重要作用一。此外，在无脊椎动物中，溶菌酶可以作为种重要的消化酶，通过分解细菌，产生的Ｃ元素和Ｎ元素还可以供无脊椎动物生长。溶菌酶还能够直接与带有负电荷的病毒蛋白相结合，可以与ＲＮＡ、ＤＮＡ、脱辅基蛋白形成复盐，从而导致病毒失去活性。溶菌酶还有许多其他功能，包括生殖、生长刺激、抗病毒、免疫调节、抗炎和抗肿瘤。因此，溶菌酶被广泛的应用在词料、食品、临床医学、生物学等领域。目前市场上所售的溶菌酶绝大多数是从蛋清中提取的蛋清溶菌酶，溶菌酶传统的分离纯化方法是采用结晶法，收率较

5、低，且原料无法回收利用，这种现状限制了溶菌酶应用和产业的发展。一柞蚕是我国特有的种经济昆虫，诱导后体内会产生多种抗性成分，溶菌酶就是其一中之。杵蚕溶菌酶与蛋清溶菌酶同属于Ｃ型溶菌酸，其成熟肽含有１２０个氨基酸，预测分子量为１３９８７．８Ｄａ，含有４个二硫键，活性中心由Ｇｌｕ３２和Ａｓｐ５０构成。为了提高柞香溶菌酶的表达量，本研究根据毕赤酵母偏爱的密码子，对作蚕溶菌＿密码子进行了’优化，利用人工合成的方法获得目的基因３，并且在基因的端加上６个组氨酸标签。构，建了作蚕溶菌酶的毕赤酵母表达系统实现了作蚕溶菌酶的分泌表达，釆用镍柱亲和层析进行分离纯

6、化．，同时分析了柞蚕溶菌酶抑菌活性。优化了在２５Ｌ发酵罐内诱导时间、诱导温度、培养基ｐＨ及甲醇浓度四个重要因素对柞蚕溶菌酶表达量的影响，从而确定最优培养条件为：诱导发酵９６ｈ、诱导温度２５Ｖ、培养基Ｈ７．０和每隔２４ｈ添加０．７５％ｖ／ｖｐ（）甲醇．４／Ｌ，２２３５４Ｕ／ｍ。，表达量最高达到了２ｇ酶活达到ｇ通过琼脂扩散方法测定了杵蚕溶菌酶对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、苍白杆菌及过氧一定的抑菌作用化醋杆菌均具有。最后研究了杵蚕溶菌酸的最适作用温度和ｐＨ，表明一柞蚕溶菌醇具有定的温度和酸碱耐受性一，这些结论都证明了

7、作蚕溶菌酶是种可以被广泛应用的溶菌酶。关键词：杵香溶菌酶；密码子优化；毕赤酵母；抑菌活性－－Ｉ密码子优化后的柞香济菌酶基闪在酵母１‘１的衷达及活性测定ＥｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖｉｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｏｄｏｎｏｔｉｍｉｚｅｄＡｎｔｈｅｒａｅａｐｙｐｅｒｎｓｏｚｍｅｅｎｅｎＰｃｈｉａａｓｏｒｓｐｙｉｌｙｙｉｉｐｔｉｇＡｂｓｔｒａｃｔｓｏｅａｎｏｗｎａｓｍｕｒａｍａｓｅ－ａｃｅｍｕａｍｅＬｚｍｌｃａｎｏｓｅａａｌｓｏｋｉｄｏｒＮｔｌｒｉｄｇｈ