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《海蚕新型抗菌肽Perinerin在毕赤酵母中的表达及活性测定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2006,26(12):45～49海蚕新型抗菌肽Perinerin在毕赤酵母中的表达及活性测定33周庆峰罗学刚叶亮申静丁艳段奚涛(中国药科大学生命科学学院生物技术中心南京210009)摘要Perinerin是一种分离自亚洲海蚕Perinereisaibuhitensis的结构新颖的抗菌肽,其对革兰氏阳性和阴性细菌均表现出强大的抑制作用;尤其对临床常见的耐药性绿脓杆菌更有明显的抑菌作用。为了解决生物提取过程中抗菌肽产量低下的问题,采用巴斯德毕赤酵母表达
2、系统,对海蚕抗菌肽perinerin进行分泌性重组表达,并进行活性检测。首先通过修改的SOE法(Genesplicingbyoverlapextension)设计三对互补引物来合成完整的perinerin基因,将该基因片段插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列载体pPICZαA中,构建了重组表达质粒pPICZαAOPEN,再将其转化至PichiapastorisGS115宿主菌,利用甲醇来诱导外源基因在阳性菌株中的表达,表达产物经TricineOSDSOPAGE电泳进行验证,并经超滤和阳离子交换层析
3、进一步纯化。生物学活性检测证实重组蛋白对金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌均具有明显抑制作用。关键词抗菌肽Perinerin毕赤酵母重组表达中图分类号Q786海洋抗菌肽是近10年来研究的又一个热点。海合成法和基因工程表达法三种。前两种方法由于操作洋环境具有低温、高压、高盐和低营养等极端特性,在程序复杂和生产成本昂贵,很难进行规模性的生产。[3]这种条件下产生的海洋抗菌肽具有很多独特的抗菌活基因工程表达法是大量生产抗菌肽的理想途径。本性:如杀菌活力更高;作用更迅速;活性更稳定,更加耐实验采用组氨酸缺陷型毕赤酵母GS
4、115作为宿主菌,热等等,甚至在高盐环境下,许多海洋抗菌肽仍然具有采用分泌性表达载体pPICZαA构建重组表达系统,选[1]抗菌活性。择SacI内切酶线性化重组载体pPICZαAOPEN,利用电本实验所研究的抗菌肽为一种海洋生物亚洲海蚕转化法将其转入GS115毕赤酵母菌株中,进而利用甲的分离纯化产物,命名为perinerin(ACCESSION:醇作为诱导物,对重组目的蛋白perinerin进行诱导表[2]P84117)。perinerin由51个氨基酸残基所构成,结构达和纯化,并对其抗菌活性进行检测分
5、析。呈现高度的保守性和疏水性;perinerin对革兰阳性和阴1材料和方法性细菌均有强大的抑制作用;尤其对临床常见的耐药性绿脓杆菌更有明显的抑菌作用。更值得一提的是,1.1材料通过BLAST对比验证,perinerin的结构与目前所有已1.1.1质粒和菌株与培养基菌种BL21、DH5α为本知的抗菌肽都不同,这提示其具有独特的发挥抗菌作实验室保存,pPICZαA载体和菌株P.pastoris/GSll5由用的一级结构和空间构象,依照这些特点,perinerin很本校生命科学学院文良柱博士惠赠。有潜力成为一
6、种抗菌新药或者新的抗菌肽作用机制研1.1.2引物和各种酶相关产品PCR引物合成及究模型。perinerin基因测序由上海生工公司完成,Taq酶、目前,抗菌肽的制备主要有生物材料提取法、化学dNTP、各种限制性内切酶均由TaKaRa公司提供。收稿日期:2006207226修回日期:2006210216T4DNA连接酶来自于Promega公司。3通讯作者,电子信箱:xitao18@hotmail.com46中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.26No.1220061.2实验方法1.2
7、.3重组质粒对酵母宿主菌GS115的转化制备1.2.1天然perinerin基因序列的改造从GeneBank毕赤酵母菌株GS115的感受态细胞,取80μl与10μg中获得海蚕perinerin成熟肽的氨基酸序列,依据毕赤SacI单酶切线性化的重组表达质粒混匀,进行电击转[4]酵母密码子偏好性的统计结果,将其氨基酸序列转化,30℃温育1h后,将菌液涂在含有100μg/mlZeocin换成相应的由毕赤酵母偏爱密码子组成的DNA序列,抗生素的YPD固体培养基平板上,30℃恒温培养2～得到完整的perineri
8、n基因碱基序列。并在基因序列的4天,筛选出阳性菌落。同时,将SacI线性化的5′端引入NotI酶切位点和起始密码子ATG,同时将pPICZαA空白质粒转化酵母,制备的pPICZαA转化EcoRI酶切位点和终止密码子TAA添加于基因序列的GS115菌株作为空白对照。[6]3′端,并分别在酶切位点边缘加入3个保护性碱基。1.2.4转化子的PCR检测按照“冻O煮O冻”法提1.2.2改造perinerin序列的人工合成和重组表达载取空酵母和重组转化
