鸡γ-干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物活性检测

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1、鸡丫．干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物活性检测ExpressionandBiologicalActivityDetectionofRecombinantChickenInterferonGamainPichiapastoris研究生：李亚玲学科：预防兽医学导师：吴艳涛教授扬州大学兽医学院2013年6月李亚玲：鸡1，．干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物活性检测鸡丫．干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物活性检测研究生：李亚玲导师：吴艳涛教授摘要干扰素(Interferon，IFN)是一种具有多功效的细胞因子，对多种免疫细

2、胞具有调节作用。由于毕赤酵母表达系统可实现高密度发酵，且其表达产物的生物活性接近天然蛋白，因此本研究将利用这一系统来表达鸡丫．干扰素(Chickeninte疵rong锄a，ChlFN-Y)，为ChIFN-Y的工厂化生产和临床应用打下基础。本研究将编码ChIFN．7成熟肽的基因克隆至毕赤酵母穿梭表达质粒pPICZaA中，构建重组质粒pPICZaA．IFN．7。将其线性化后，采用电穿孔法转化到毕赤酵母GSll5细胞中。挑取单菌落，先利用YPDS．ZeocinTM平板筛选出高抗性克隆，再通过MMH、MDH平板和PCR

3、方法筛选出2株His+Mut+表型的阳性重组菌株。重组菌株用甲醇诱导可表达出大小约为17l(D的重组ChlFN-丫(rchlFN．1，)，与天然ChlFN吖一致；Westemblotting表明，rchlFN一丫可与研制的针对ChlFN．7的特异性多抗血清相结合。经生物信息学分析，毕赤酵母表达的rchlFN吖的等电点约为pH5．2，因此采用超滤浓缩、透析和DEAE阴离子交换层析来纯化表达产物。经SDS．PAGE鉴定，纯化产物的纯度约为70％。DFl．VSV系统检测结果表明，纯化后的rchlFN吖具有较强的抗病毒

4、活性，效价达10，240IU／mL。以rchlFN．Y为佐剂与H9亚型禽流感灭活疫苗联合免疫SPF鸡，研究rchIFN吖是否对疫苗的免疫应答具有增强效果。经流式细胞术检测，使用rChlFN吖试验鸡的外周血中CD4+T淋巴细胞相对百分含量以及CD4UCD8+比值显著高于未使用rChIFN吖的试验鸡(p<0．05)。通过血凝抑制试验检测疫苗免疫后试验鸡血清中的HI抗体水平，并于免疫后35天用H9亚型禽流感病毒进行攻击，检测各组鸡的排毒情况。结果表明：在疫苗接种后的第14天，使用rchI州．丫试验鸡的HI抗体效价达到

5、高峰，早于未使用rcllIFN．丫的试验鸡达到高峰；且使用rchlFN吖试验鸡的HI抗体效价显著高于未使用rchIFN吖的试验鸡(p<0．05)；H9亚型禽流感病毒攻击后，使用rchIFN吖的试验鸡排毒率显著低于未使用rcllIFN吖的试验鸡(p<0．05)。以上试验结果表明，rchIFN．丫在体内外均有良好的生物学活性，并可能作为扬少H大学硕士学位论文2疫苗佐剂在生产上得到应用。关键词：鸡Y．干扰素；毕赤酵母；表达；纯化；佐剂李亚玲：鸡Y一干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物活性检测ExpressionandBi

6、ologicalActivityDetectionofRecombinantChickenInterferonGamainPichiapastorisM．S．Candidate：YalingLiAdvisors：Prof．YantaoWuAbstractInterferonisapleiotropiccytol(inewithimmunomodulatoryeffectsonavarietyofimmunecells．PichiaPastorisexpressionsystemcouldprovidesanal

7、ternativeforscale．upproductionofrecombinantproteins，andthebioactivitiesofproductsclosetonaturalproteins．SOwechooseittoexpresschickeninterferon-gamma(ChlFN吖)，tolaytheoreticalfoundationsfortheindustrialproductionandclinicalapplication．ThenucleotidesequenceofCh

8、lFN-丫matureproteinwasclonedintotheexpressionvectorpPICZaAtoconstructrecombinantplasmidpPICZaA．IFN．丫．Afterlinearized，therecombinalltplasmidwasthentransformedintothe尸pastorisGSl5byelectroporation．