鸡avbd2成熟肽在毕赤酵母中表达及其抗菌活性的分析

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1、摘要鸡源抗菌肽是牛物体受到外界病原微生物入侵时产牛的一类带正电荷的小分子活性多肽。而鸡B一防御素(Avianbeta—defensin)作为抗菌肽中较为重要的一种，因其抗菌谱广且效率高，作用机制独特，不易使病菌对其产牛抗性等特点，在抗牛素的抗药性日趋严重的情况下，极有可能成为新的抗牛药物的来源，也因此鸡B一防御素成为了人们当前研究的热点之一。本实验选鸡B．防御素．2(AvBD2)作为研究对象，运用基因工程技术，将人工合成的AvBD2成熟肽基因成功克隆到pPIC9k载体上，构建了pPIC9k—AVBD2重组表达载体，经甲醇诱导表达后得到含有A

2、VBD2目的蛋白的上清液，对上清产物的抗菌活性进行了研究。具体内容和结果如下：1AvBD2成熟肽基因的人工合成根据NCBI报道的AVBD2(登录号：NM204992)cDNA编码区序列，在AVBD2成熟肽基因两端加上合适的酶切位点＆DRI和ⅣDfI后交由TaKaRa公司进行AvBD2成熟肽基因的合成。将成熟肽基因克隆到pMDl8．T-simple载体上，构建成克隆载体pMDl8．T-simple．AvBD2。2AVBD2成熟肽在毕赤酵母中的表达及体外抑菌试验检测将pMDl8．T-simple．AVBD2双酶切下的AvBD2基因片段克隆到pP

3、IC9k载体，构建了pPIC9k．AvBD2表达载体。PCR鉴定的阳性菌株经质粒提取后做测序鉴定，测序结果经BLAST比对显示，构建的表达载体中的AvBD2成熟肽基因与GenBaIll(中公布的一致，同源性达100％。然后将获得的重组分泌表达质粒pPIC9K．AVBD2用勋cI酶线性化，并用电转化法转入RcJlz砌p口s幻胁GS115，筛选出阳性克隆后用甲醇诱导，表达上清经Thcine．SDS．PAGE和抑菌实验检测，结果表明，AvBD2成熟肽基因成功整合到GSll5的基因组中，得到了能够表达AvBD2成熟肽的稳定酵母菌株。诱导表达的上清液

4、经啊cine．SDS—PAGE检测得知AvBD2蛋白分子量在5．8kDa左右，表达上清能抑制包括大肠杆菌(CMCC44102)、禽致病性大肠杆菌(CVCCl565)、鸡白痢沙门氏菌(S2)、铜绿假单孢杆菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、产气肠杆菌(CMCC45103)在内的多种细菌的牛长。3AVBD2成熟肽表达上清对雏鸡感染大肠杆菌病的预防效果研究以罗曼蛋鸡为对象，初步研究了不同浓度的AvBD2成熟肽表达上清对致病菌感染雏鸡的预防效果。本实验选用了禽致病性大肠杆菌CVCCl565感染雏鸡，在确定了细菌两次最佳攻

5、毒剂量后，对11日龄雏鸡连续腹腔注射5天不同浓度的表达上清液，每天每只O．2mL。于21日龄时经腹腔注射l×109c纠mL大肠杆菌CVCCl565，0．5mL／只。观察48h后如果PBS对照组仍有雏鸡存活，则再经腹腔注射1×108cm／mL大肠杆菌CVCCl565，0．5mL／只。之后再观察48h，确定PBS对照组雏鸡全部死亡后停止感染。结果发现，两次攻毒试验之后，注射不同浓度表达上清液组雏鸡全部存活，而空酵母表达上清对照组部分存活，PBS对照组雏鸡全部死亡。由此表明，AvBD2成熟肽表达上清显示出了较好的体内预防效果。综上所述，本研究成功

6、构建了pPIC9k．AvBD2表达载体，将该表达载体电转化到酵母体后经甲醇诱导表达，啊cine—SDS—PAGE检测到分子量在5．8kDa左右的目的条带，表达的AVBD2成熟肽上清对大肠杆菌(CMCC44102)、禽致病性大肠杆菌(CVCCl565)、鸡白痢沙门氏菌(S2)、铜绿假单孢杆菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、产气肠杆菌(CMCC45103)均有一定的抑菌作用；在禽致病性大肠杆菌感染雏鸡的试验中，注射AvBD2不同浓度表达上清组与空酵母表达上清组、PBS对照组相比，死亡率均极显著降低(P<0．01)，

7、表达上清显示了较好的预防效果。关键词：AVBD2，成熟肽，毕赤酵母，分泌表达，抗菌活性AbstractThechickenantimicrobialp印tideswhichwcregeneratedwhenextemalpathogenlcmlcroo唱anismsinVadedchickenwerepositivelycha略edsmaUmoleculeactlVepeptldes．Asoneofthea

8、1timicrobialpeptides，avianbeta．de矗msin(Avl3D)islmponant·Becauseofit

9、santi-bact鲥albroadspectmmhi曲e伍ciency，panicularmechallismaIldpathogenicmicroorgaIlismisdi街