斑点叉尾LEAP2成熟肽在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性.pdf

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1、文章编号:1674-5566(2017)01-0023-08DOI:10．12024/jsou．20160401759斑点叉尾LEAP2成熟肽在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性1，21，21，2孙立人，陶妍，高北(1．上海海洋大学食品学院，上海201306;2．上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306)摘要:LEAP2(Liverexpressedantimicrobialpeptide-2)抗菌肽是一类主要在动物肝脏中表达的小分子肽，它们在动物的免疫系统中发挥了重要作用。斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)LEAP2的一

2、级结构由信号肽和原前体肽组成;原前体肽由66个氨基酸残基组成，近羧基端的41个残基组成了其成熟肽区域(mLEAP2)，该区域决定了LEAP2的生物学活性。本文以斑点叉尾mLEAP2为研究对象，通过建立毕赤酵母表达系统，实现了mLEAP2在毕赤酵母中的重组DNA表达，优化的表达条件为:29℃、pH6、250r/min、0．5%甲醇、120h。Tricine-SDS-PAGE分析表明:表达产物经固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化后，获得了高纯度的目的蛋白。经Folin-酚法测定，纯化产物的浓度为0．22mg/mL，推算至表达量为2．2mg/L。进一

3、步通过MALDI-TOF/TOF质谱分析对纯化产物的结构进行鉴定，结果证明:获得的纯化产物为预期的重组体mLEAP2(rmLEAP2)。此外，抑菌实验结果显示rmLEAP2具有明显的抑制枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的活性。关键词:斑点叉尾;LEAP2成熟肽;毕赤酵母;重组DNA表达中图分类号:S917文献标志码:A抗菌肽是动物先天免疫系统的重要组成成LEAP2基因外源表达方面的研究报道较少，已有分，其分子量一般为1．5～10ku，它们对细菌、真的报道大多数也是基于大肠杆菌原核表达系统［10-11］菌、有包膜的病毒乃至癌细胞等均

4、有抑制作用，的重组DNA表达，例如斑点叉尾、大黄［1-2］［7］［2］故又被称为动物的“第二防御体系”，也因此鱼和人类LEAP2基因在大肠杆菌中的表达;被认为是替代抗生素的良好候选者。LEAP2至于LEAP2基因真核表达方面的研究报道则更［12］(Liverexpressedantimicrobialpeptide-2)抗菌肽是少，仅王红亮报道了小鼠LEAP2基因在毕赤一类主要在动物肝脏中表达的小分子肽，最初是酵母中的表达，而鱼类来源LEAP2基因的真核重［3］从人血液超滤产物中得到，被发现能抵抗革兰组DNA表达还未见报道。氏阳性的巨大芽孢杆菌(

5、Bacillusmegaterium)、枯本研究室在过去的几年中以斑点叉尾草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、藤黄微球菌LEAP2抗菌肽为研究对象，开展了重组DNA表(Micrococcusluteus)、金黄色葡萄球菌达方面的研究，旨在开发用于替代抗生素的绿色(Staphylococcuscarnosus)和革兰氏阴性的灰色奈饲料添加剂。就LEAP2的结构而言，除去信号肽瑟菌(Neisseriacinerea)等细菌。鱼类中的LEAP2之后的原前体肽由66个氨基酸残基组成，近羧［4］基因首次发现于虹鳟(Oncorhynchusmyk

6、iss)，基端的41个残基为成熟肽区域，该区域决定了［5］目前，多种鱼类的LEAP2基因已经被相继分离和LEAP2的生物学活性;4个高度保守的半胱氨［5］克隆，包括斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)、牙酸残基位于成熟肽区域，它们在空间上可形成2［6］鲆(Paralichthysolivaceus)、大黄鱼(Larimichthys对二硫键，对LEAP2的稳定和活性起了重要作［7］［8］crocea)、草鱼(Ctenopharyngodonidella)和用。鉴于此，在先前的研究中，本实验室以［9］鱼(Miichthysmiiuy)

7、等。但迄今为止，关于LEAP2成熟肽“mLEAP2”为研究对象，开展了基收稿日期:2016-04-28修回日期:2016-05-12基金项目:上海市教育委员会产学研项目(15CXY30);农业部都市农业(南方)重点实验室开放基金项目(UA201307)作者简介:孙立人(1990—)，男，硕士研究生，研究方向为水产生物化学与分子生物学。E-mail:442333777@qq．com通信作者:陶妍，E-mail:ytao@shou．edu．cn24上海海洋大学学报26卷于大肠杆菌表达系统的重组DNA表达，但由于蛋白质分子量标准购自北京天根生物科技有限原

8、核表达系统存在表达量低、无翻译后折叠修饰公司;超滤设备Vivaflow200购自德国Sartorius功能、易在细胞内形成