重组人巨细胞病毒（hcmv）嵌合肽的构建及其在毕赤酵母中的表达

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1、暨南大学硕士学位论文重组人巨细胞病毒（HCMV）嵌合肽的构建及其在毕赤酵母中的表达姓名：郑育声申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：谢琪璇20020101独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得壁盘查窒或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：郑南户签字日期：Ⅻ)年r月‘7日学位论文版权使用

2、授权书本学位论文作者完全了解蟹南文学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权!殛盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名却甯产签字日期：泗2年3-月f7日学位论文作者毕业后去向工作单位：通讯地址：导师签名：卸砖波签字日期：印见年j月『7同电话：邮编：摘要为了表达人巨细胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)中抗原性较强的两

3、段蛋白片段一gp52c末端和ppl50C末端的嵌合肽，用基因工程技术构建适于酵母表达系统的重组表达质粒。将重组质粒转化巴斯德毕赤酵母(Pfchiapastoris)以此表达目的蛋白，并对表达蛋白进行鉴定。根据人巨细胞病毒糖蛋白gp52和磷酸蛋白Dpl50C末端的eDNA序列，设计出2对引物。利用重组PCR的方法，以病毒培养液上清为模板，把二个目的基因串联在一起。所得的DNA片段经EcoRI和Notl双酶切后用T4DNA连接酶与DPIC9K载体进行连接，然后导入大肠杆菌DH5a，用PCR法筛选阳性转化子，并用双酶切和序列测定方法鉴定重组质粒

4、。重组质粒线性化后，用电击法将重组质粒转化入巴氏毕赤酵母，在缺组氨酸的MD板上筛选阳性菌落，然后用不同浓度的G418--YPD板筛选多拷贝插入单菌落。培养多拷贝插入的酵母细胞，用甲醇诱导目的蛋白的分泌，SDS—PAGE和Westernblotting鉴定表达蛋白。重组PCR扩增出两端带有EcoRI和NotI酶切位点的目的基因片段。目的基因经双酶切后连接载体pPIC9K，然后导入大肠杆菌mH5a中，在含氨卞青霉素(AMP)的LB板上用PCR反应筛选出阳性菌落，双酶切结果表明目的基因已插入载体中，且方向正确，测序结果进一步证明人巨细胞病毒重组

5、基因表达质粒成功地克隆了目的基因片段。重组质粒转化巴氏毕赤酵母，G418筛选出多拷贝插入的单克隆，甲醇诱导多拷贝插入的单克隆酵母细胞分泌目的蛋白，培养液上清经SDS-PAGE电泳分析，在蛋白质印迹中检测到培养液上清有一表观分子量为36KD，能与羊抗HcMV多克隆抗体发生发应的条带。实验结果表明重组人巨细胞病毒嵌合肽成功地在巴斯德毕赤酵母中获得表达。关键词：人巨细胞病毒；重组嵌合肽；pPIC9K；巴斯德毕赤酵母；重组PCR；表达AbstractInordertoexpresstherecombinantpeptideofbothgp52an

6、dppl50C-terminalpeptidesfromhumancytomegalovirus(HCMV)，whichseemtoshowgoodantigenicity．RecombinantDNAtechnologywasusedtoconstructrecombinantplasmid，whichwastransformedintothePichiapastoristoexpresstheinterestingpeptide．Thebiologicalfunctionoftheinterestingpeptidehasbeenid

7、entified．AccordingtothecDNAsequenceofgtycoprotein52(gp52)and曲os曲oproteinl50(ppl50)ofhumaneyto璜egaloVir娃岛twopairsofprimersweredesigned．ThesupernateofviruscultarewasusedastempletinoverlappingPCR，thentheinterestinggenewasobtained．AfterdigestedwithEcoRIandNotl，theobtainedDNAf

8、ragmentwaslinkedwithpPIC9KbyT4DNA1igaseandthentherecombinantplasmidWaStransformedintocompetentDH