罗非鱼hepcidin 1-5成熟肽在毕赤酵母中的表达和活性研究.pdf

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1、动物医学进展。2014，35(7)：38—43ProgressinVeterinaryMedicine罗非鱼hepeidin1—5成熟肽在毕赤酵母中的表达和活性研究梁盈，梁瑞，张永安。，祁克宗，涂健，彭开松(1．安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036；2．中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室，湖北武汉430072)摘要：为获得重组酵母分泌表达的莫桑比克罗非鱼hepcidin并进行其功能研究，将罗非鱼hepcidin1—5(TH1—5)成熟肽cDNA插入表达载体pPIC9K，获得重组分泌表达质粒pPIC9K—TH1—5

2、，电转化毕赤酵母GS115，阳性克隆经甲醇诱导获得表达上清；表达上清冻干品经Dot—ELISA检测，并分析了表达产物对指示茵和鸡外周血淋巴细胞的影响。结果表明，TH1-5成熟肽可通过表达质粒pPIC9K在毕赤酵母中实现分泌型表达，DOt—ELISA检测表达上清中含有TH1—5。重组表达的TH1—5对大肠埃希菌(CMCC44102)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、粪肠球菌(ATCC29212)具有明显的抑菌活性；含重组表达TH1-5的上清冻干品(6．25mg／mL)可协同ConA(0．125／~g／mL

3、)或LPS(0．125ug／mL)促进鸡外周血淋巴细胞的增殖。关键词：罗非鱼hepcidin；酵母表达；斑点一酶联免疫吸附试验；抑茵活性；淋巴细胞增殖中图分类号：R979．5文献标识码：A文章编号：1007—5038(2014)07—0038—06罗非鱼是联合国粮食及农业组织(Foodand增强L7刮。至于基因工程表达的罗非鱼hepcidin及AgricultureOrganization，FAO)推广的世界性养殖其功能，还未见报道。本文拟采用酵母分泌型表达品种，其对世界水产养殖的重要性仅次于鲤科鱼类系统表达罗非鱼hepcidin1-5，建立检

4、测hepcidin的和鲑鳟鱼类。中国是世界上罗非鱼产量最大的国Dot—ELISA方法，并检测其对常见病原菌的抗菌活家，罗非鱼也是我国出口量最大的淡水养殖品种。性及其对鸡外周血淋巴细胞增殖的效应，期望能为但近年来，水产动物的细菌性疾病引起的损失惨重，新型绿色抗生素替代品的研发提供借鉴。虽然抗菌药物是目前的主要防治手段，但容易产生1材料与方法耐药性和导致组织中抗菌药物残留，给食品安全埋下隐患，并影响水产品出口[1]。因此，很有必要寻找1．1材料新的抗生素替代品。抗菌肽是一类广泛存在于生物1．1．1菌株和质粒酵母表达质粒pPIC9K和毕体的内源性小肽

5、，其独特的作用机制使得微生物不赤酵母GS115，为Invitroge公司产品；大肠埃希菌容易产生抗药性，是备受关注的抗生素替代品。抗DH5Q、大肠埃希菌(CMCC44102)、金黄色葡萄球菌微生物肽除了具有抗菌、抗囊膜病毒、抗肿瘤、抗真(ATCC25923)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)和粪肠菌等天然免疫活性外，还具有趋化、免疫调节等功球菌(ATCC29212)，均由本实验室保存。能_2j。自2000年hepeidin被发现以来就成为研究1．1．2主要试剂和培养基限制性核酸内切酶最为活跃的抗微生物肽类群，hepcidin主要在肝脏EcoR

6、I、Not工和Bgl1I为Frement公司产品；T4表达，但在其他组织和体液中也有广泛的分布。DNALigase和培养基为BBI公司产品；PremixExhepeidin含有8个半胱氨酸，通过二硫键形成稳定TaqVersion2．0为天根生化科技(北京)生物有的l3折叠，这种结构可以通过成孔作用增加细胞膜限公司产品；小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)和DL2000的通透性，阻断呼吸链，杀伤病原微生物_3]。莫桑比等为TaKaRa公司产品；辣根过氧化物酶标记的山克罗非鱼有3种hepcidin，人工合成的罗非鱼hepci—din具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤

7、活性[4刮；而转罗非鱼羊抗兔IgG和DAB显色试剂盒等为北京中杉金桥hepcidin基因的虾和鱼对水产动物病原菌抵抗能力生物技术有限公司产品；LPS和ConA为Sigma公收稿日期：2013—12—06基金项目：国家自然科学基金项目(30800811)；国家重点基础研究发展计划项目(2014CB138600)；安徽农业大学引进与稳定人才基金项目(yj2006—13)作者简介：：梁~(1988一)，女，河南孟州人，硕士，主要从事基础兽医学研究。*通讯作者梁盈等：罗非鱼hepcidin1—5成熟肽在毕赤酵母中的表达和活性研究39司产品；其他试剂均为

8、分析纯；罗非鱼hepcidin1—5定阳性重组酵母转化子，并测序验证。同时将(GIKCRFCCGCCTPGICGVCCRF，纯度95)和BglⅡ线性化