鸡β-防御素-13成熟肽cdna的克隆及在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达

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1、万方数据四川农业大学硕士学位论文论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生虢洛乃I哗年i月I沙关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文

2、的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。日本论文不保密。口本论文保密，在一年解密后适用本授权。(请在以上口内划“4”)研究生签名：导师签名：加f年年6月＼乙日Ⅷ(u年6月I’L日万方数据摘要防御素是存在多种生物体内的一种小分子肽，具有广谱的抗细菌、真菌、病毒等生物活性，是生物机体天然免疫的重要组成部分。依据相关报道，鸡的体内共存在14种防御素，且均为B一防御素。用乙酸提取的方法从鸡的肠道

3、中分离到的鸡B．防御素13(Gal．13)，具有一定的生物活性，但提取工艺繁琐耗时，且提取量有限。而关于用基因工程方法获得Gal一13的报道相对较少，本研究主要针对鸡Gal一13成熟肽的基因进行了克隆，通过构建Gal．13成熟肽cDNA序列的原核表达载体和真核表达载体，实现其在大肠杆菌BL21和毕赤酵母x一33中的表达，为进一步研究Gal．13的生物活性和其在畜牧业中的生产应用奠定了基础。1．Gal．13基因序列的扩增及其在大肠杆菌中的诱导表达Gal一13cDNA的全场基因序列为312bp，编码的Gal．13共包括6

4、0个氨基酸，其中，信号肽序列为前20个氨基酸，前导肽序列为4个氨基酸，成熟肽序列包括36个氨基酸。依据NCBI中公布的Gal．13(登陆编号：DQ858323)基因序列并借助Primer5．软件设计引物，以三黄鸡的肝脏总RNA为模板，通过RT—PCR技术扩增Gal．13的全长cDNA序列，将测序结果经Blast比对后，借助MEGA软件，采用Neighbor-Joining法，与其相关序列进行比对分析并构建系统进化发育树。序列经鉴定分析后设计引物，扩增Gal．13成熟肽，并在序列中引入限制性内切酶BamHI和XhoI的

5、酶切位点，将所得序列与表达载体pGEX．4T．1经双酶切后构建重组表达质粒pGEX-4T．1．Gal一13，并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21进行诱导表达，结果显示Gal一13成熟肽在大肠杆菌中得到大量表达，且最佳诱导表达时间为5h，最佳诱导剂的浓度为0．2mmol／L，SDS-PAGE和Western—blot检测结果显示，表达的含有GST标签的重组蛋白分子量大小约为30ku，表明Gal一13成熟肽序列在大肠杆菌中得到了成功表达，但主要以包涵体的形式存在，存在于上清中的可溶性目的蛋白较少。2．Gal一13成熟肽基因

6、序列在毕赤酵母中的诱导表达依据Gal．13基因序列重新设计引物，并在其中引入限制性内切酶EcoRI和勋nI的酶切位点，扩增Gal一13成熟肽基因序列后进行双酶切，将其插入到酵母分泌表达载体pPICZaA中，，构建重组表达质粒pPICZaA．Gal．13，将鉴定万方数据正确的重组质粒，用限制性内梅SacI进行线性化处理后，电击转化毕赤酵母X一33，并利用甲醇对阳性重组菌株进行诱导表达，诱导表达上清用Tricine．SDS．PAGE凝胶电泳进行鉴定。结果显示，Gal．13成熟肽基因序列成功插入到表达质粒pPICZnA中且

7、重组质粒成功转化了毕赤酵母x一33，经过鉴定分析，获得了表型为Mut+的高抗性重组菌株，在甲醇的诱导下，Gal．13成熟肽在菌液上清中得到了表达，Tricine．SDS．PAGE凝胶电泳结果显示，重组菌株在诱导72h时，Gal一13在上清中得到大量的表达，在5．9ku的位置出现了目的蛋白条带，与预期结果一致，抑菌试验表明，Gal．13对鸡沙门氏菌(CVCC534)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)均具有一定的抑制作用。关键词：Gal一13：成熟肽；大肠杆菌；毕赤酵母；诱导表达，抑菌试验II万方数据cDNAclon

8、ingofGal-13maturepeptideandits：pres。1’’liandPichiapastt"exDresslonin／5．cOllanlapastonsXuGuo—yang(Departmentofpreventiveveterinary)DirectedbyPanKang—-chengandYangJin·-longAbs