疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达及高密度发酵工艺研究

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1、分类号学号M201171554学校代码10487密级硕士学位论文疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达及高密度发酵工艺研究学位申请人：方中刚学科专业：生物化学与分子生物学指导教师：徐莉副教授答辩日期：2014年1月15日万方数据AThesisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofBiochemistryandMolecularBiologyStudiesonHigh-levelExpressionofTherm

2、omyceslanuginosuslipaseinPichiapastorisanditsHighCell-densityFermentationProcessCandidate:FangZhonggangMajor:BiochemistryandmolecularbiologySupervisor:Assoc.Prof.XuLiHuazhongUniversityofScienceandTechnologyWuhan430074,P.R.ChinaJanuary,2014万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论

3、文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索

4、，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。(请在以上方框内打“√”)学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日万方数据华中科技大学硕士学位论文摘要脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)能催化水解、转酯、酯化等多种反应，在食品、化工、能源、医药等领域具有广泛应用。但是，脂肪酶的制备成本高这一瓶颈问题制约着其在工业上的应用。因此，构建脂肪酶高效工程菌和优化发酵工艺提高脂肪酶的表达量一直是脂肪酶研究的热点课题。耐热、耐碱性脂肪酶能应用

5、于较苛刻反应条件，使用范围更广，具有巨大商业开发潜能，越来越受到学者的重视。疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyceslanuginosuslipase,TLL)属于碱性脂肪酶，具有良好的热稳定性、水解活性、转酯活性以及有机溶剂耐受性，广泛应用于油脂水解、有机合成、食品加工，药物拆分等领域。进一步提高TLL的表达量，降低其生产成本具有重要意义。毕赤酵母具有遗传操作简单、对蛋白的翻译后修饰、适合高密度发酵等优点，已被用来表达成百上千种重组蛋白。本文通过采用多种策略并举构建高效表达脂肪酶TLL的工程菌，并通过优化

6、摇瓶培养和发酵罐高密度发酵条件，进一步提高了TLL的表达量。主要研究内容与结果摘要如下：+（1）利用实验室保存的质粒DNA克隆了tll基因，构建了Mut的重组工程菌GS115/9K-tll。通过抗性平板、酶活检测平板以及摇瓶发酵筛选到一株最高酶活力为1,950U/mL的GS115/9K-tll3#克隆子。对其摇瓶培养单因素条件优化，酶活力提高了2.23倍，达到4,350U/mL，优化条件为：500mL的摇瓶起始装液量为20mL，诱导温度27℃，培养基起始pH7.0，每24h甲醇添加量1.2%，接种量为4%，甲醇诱

7、导144h。重组目的蛋白经MALDI-TOF-TOF的蛋白质质谱分析，并通过肽段序列比对，确证表达的目的蛋白是TLL。（2）分别构建了诱导型表达质粒pPICZαA-tll、pFZα-tll和组成型表达质粒pGAPZαA-tll。以重组工程菌GS115/9K-tll3#为宿主细胞，二次电转化构建了3种双质粒表达重组工程菌。通过平板筛选和摇瓶发酵筛选得到3株高酶活力菌株GS115/9Ktll-ZαAtll40#、GS115/9Ktll-FZαAtll46#和GS115/9Ktll-GAPtll45#，在摇瓶优化条件下

8、最高酶活力分别达6,600U/mL、6,000U/mL、4,800U/mL，较GS115/9K-tllI万方数据华中科技大学硕士学位论文3#分别提高了52%、38%和10%，总蛋白含量也分别提高了100%，40%和29%。利用荧光定量PCR技术确定了重组菌GS115/9Ktll-ZαAtll40#、GS115/9Ktll-FZαAtll46#、GS115/9Ktll-GA