毕赤酵母高密度发酵生产白地霉脂肪酶的研究

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1、AThesisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMicrobiologyHighcell-densityfermentationofGeotrichumcandidumlipaseGCLinrecombinantPichiapastorisCandidate：FengKeMajor：BioengineeringSupervisor：Prof.YunjunYanHuazhongUniversityofScience&TechnologyWuhan430074,P.R.ChinaJune,

2、2012独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制

3、手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。(请在以上方框内打“√”)学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华中科技大学硕士学位论文摘要白地霉脂肪酶(Geotrichumcandidumlipase，GCL)对具有C9位顺式双键的长链不饱和脂肪酸具有高度底物特异性，基于这一性质可选择性地水解脂肪酸而富集高营养价值的多不饱和脂肪酸或选择性酯化分离共轭亚油酸异构体，应用潜力巨大。+s本文对含有GCLB基因的重组毕赤酵母(Pichiapastoris)Mut表型和Mut表型工程菌进行了摇瓶发酵条件优化及10-L发酵罐高密度发酵产酶条件优化。

4、主要研究结果如下：#（1）将实验室构建的X-33/pPICZα-gcl57进行罗丹明B平板检测及摇瓶发酵酶活验证，其初始酶活力为140U/mL(橄榄油乳化液,碱式滴定法)。对该菌株的摇瓶发酵条件进行了优化，其最佳产酶条件为装液量40mL/500mL三角瓶、pH7.0、诱#导时间72h、甲醇添加量1%，优化后酶活力达到375U/mL。对57重组子进行了10-L发酵罐高密度发酵条件优化研究，其最佳诱导产酶条件为：细胞生长阶段温度29.0°C、pH5.0，诱导阶段温度27.0°C、pH6.0。最佳条件下发酵162.8h，生物量达到338g/L，蛋白含量达到2.68g/L，酶活力达到5,000

5、U/mL，酶活生产率达到30.69U/(mL·h)。采用甲醇与甘油混合补料，发酵139.8h生物量达到398g/L，蛋白含量达到2.56g/L，酶活力达到5,600U/mL，酶活生产率达到40.06U/(mL·h)，相对甲醇单独补料酶活提高16.7%，酶活生产率提高46.0%；而采用甲醇与山梨醇混合补料，发酵123h生物量达到395g/L，蛋白含量达到2.74g/L，酶活力达到6,000U/mL，酶活生产率达到48.78U/(mL·h)，相对甲醇单独补料酶活提高25.0%，酶活生产率提高78.2%。（2）通过电转将载体pPICZα-gcl整合至P.pastorisKM71H中，得到一株

6、酶活s#力最高达215U/mL的Mut表型33重组子，其摇瓶诱导产酶最佳甲醇添加量为0.6%。对其进行10-L发酵罐高密度发酵，甲醇单独诱导发酵196.7h，生物量达到332g/L，蛋白含量达到2.61g/L，酶活力达到5,450U/mL，酶活生产率达到27.69U/(mL·h)。采用甲醇与山梨醇混合补料发酵168.3h，生物量达到394g/L，蛋白含量达到3.06I华中科技大学硕士学位论文g/L，酶活力达到6,500U/mL，酶活生产率达到38.62U/(mL·h)。#（3）将实验室构建的双启动子重组菌GS115/9Kgcl-FLDgcl26进行10-L发酵罐混合碳源补料发酵研究。以

7、甲醇和山梨醇作为混合碳源进行诱导，发酵113.1h，生物量达到396g/L，蛋白含量达到4.52g/L，酶活力达到11,200U/mL，酶活生产率达到98.98U/(mL·h)。s（4）对比三株工程菌在10-L发酵罐中的发酵特性及产酶情况，结论为：Mut+型参数变化较Mut型更稳定；甲醇与山梨醇混合补料可以明显减少色素（FAD）的产生；采用甲醇与山梨醇混合补料相对甲醇单独补料，酶活力提高20%，酶活生产率提高30%~60%；而采用分子手段构建的