巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白的研究

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1、北京化工大学硕士学位论文巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白的研究姓名：刘彦丽申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：马润宇;苏志国2003.4.20巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白的研究摘要人血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质成分，约占血浆总蛋白的60％，在人体内具有维持血液渗透压和携带血液中多种配基与组织进行交换等生理功能。临床医疗中用于手术输血和危重病人补液，治疗创伤休克、发烧、水肿和大出血，且能增强人体抵抗力，是重要的临床药物。本文对毕赤酵母(Pichiapastoris)发酵生产重组人血清白蛋白(rHSA)的高密度培养条件及离子交换层析初步分离rHSA粗品进行了研究

2、。／对毕赤酵母发酵生产人血清白蛋白生长期培养条件的初步考察可以确定选用YPD作为种子培养基，浓度4％，(NI-14)2S04浓度109／L，后不离心直接流加甲醇诱导。装液量50ml／500ml三角瓶，甘油PTMl浓度4ml／L，第一阶段结束在全合成培养基的基础上考察了诱导过程中添加(NH4)，SO。、微量元素PTMl、油酸、甲醇加量及pH等因素对重组人血清白蛋白表达的影响，发现PTM。能显著提高白蛋白的表达，每12小时补加2-6ml／L甲醇的PTMl蛋白表达量最大。诱导期硫酸铵浓度维持在39／L左右蛋白表达量最大，高于39／L抑制蛋白表达。酸性环境不利于蛋白表达，诱导过程维持pH6．

3、0左右最佳。甲醇最佳诱导浓度为10ml／L。添加005％的油酸可有效提高蛋白表达。可以此作为发酵罐上发酵培养流加成分的参考。过高浓度的甲醇会抑制毕赤酵母细胞的生长，影响重组人血清白j!室些三查堂堡主兰堡垒苎—————————————————一蛋白的表达，因此，提高外源蛋白表达量的关键是通过合适的策略控制发酵罐上甲醇的流加。在此比较了几种流加策略对白蛋白表达的影响。通过溶氧(DO)控制甲醇的流加时不能有效地防止甲醇流加过量。通过气相色谱离线检测控制甲醇的流加防止了甲醇流加过量，但甲醇浓度的波动较大，影响了毕赤酵母Mut+菌株产物的表达。另外，在流加甲醇的同时，以限制性速度流加甘油可以增

4、加表达期间的能量供应，提高产物的表达量。阴离子交换载体DEAE—SepharoseFF对人血清白蛋白的吸附、脱附的基础研究表明，DEAE．SepharoseFF用于rHSA的层析分离，有较高的吸附容量，载体的脱附再生较为容易。)户。—一男关键词：重组人血清白蛋白岁发嗲高密度培羚毕赤酵彤避换层析、IIj!塞些三查兰婴主兰焦堡塞——FermentationProductionofRecombinantHumanSerumAlbuminbyPichiaPastor括ABSTRACTHumanserumalbum(HSA)isthemajorproteincomponentofthehuma

5、nplasma，andisabout60percentofthetotalproteinofthehumanplasma．HSAisproducedintheliverandislargelyresponsibleformaintainingthenormalosmolarityofthebloodstream，butitalsofunctionsasacarrierfornumeroussmallmolecules．HSAplaysanimportantroleinclinicaltherapyofseverehypoalbuminemiaortraumaticshock．Them

6、ethylotrophicyeast，Pichiapasmr括，withmanyadvantagessuchashighexpression，stalegeneticsandproteinsecretion，isbeingstudiedsinceithasbeenfoundtobeausefulorganismforefficientlyexpressingrecombinantHSA．Inthispaper，westudiedthehighdensitycultivationofacombinedstrainofproducing—rHSAPichiapastor括andthese

7、parationofrHSAbyionexchangechromatography．Theconditionsofthegrowthphasewereinitiallyinvestigated．TheoptimalseedmediumwasYPD．Thevolumeofmediumwas50mlina500mlbaffledflask．Theconcentrationofglycerolwas4％，and(NH4)2S04was109／L．Addmetha