疏绵状嗜热丝孢菌遗传转化体系的建立及蛋白激酶定位和敲除载体的构建

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1、山东农业大学硕士学位论文疏绵状嗜热丝孢菌遗传转化体系的建立及蛋白激酶定位和敲除载体的构建姓名：韩华申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：李多川20120615山东农业大学硕士学位论文中文摘要疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)是一种广泛分布的嗜热真菌，是真核生物中生长上限温度最高的一种真菌，从该菌中已分离了多种嗜热酶，并进行了真核表达，使得该菌种在工、农业生产和微生物研究中的作用越来越大。目前，对该嗜热菌感受和传导信号的机制尚不清楚。通过遗传转化，向菌株基因组随机插入外源质粒DNA，构建该茵的突变体，对探索该菌的嗜热性机制具有重要意义。此外

2、，遗传转化体系的构建为研究基因的功能，分离功能基因提供了重要的手段，也为外源基因在其体内的表达提供了有效地途径。农杆菌介导的转化因其优点众多而得到广泛的利用，而此方法尚未在嗜热真菌的转化中获得成功。本文以嗜热真菌T．1anuginosus为研究对象，首次利用农杆菌介导的方法建立了其遗传转化体系，并对该体系的转化条件进行了优化，包括农杆菌菌株，孢子萌发时间，孢子浓度及乙酰丁香酮的浓度对转化效率的影响。最终确定农杆菌菌株EHAl05在孢子萌发4h，孢子浓度为5×106个／皿，共培养时AS浓度为5000M时，转化效率达到最高。随机挑选转化子进行PCR验证，结果证明潮霉素基因已经整

3、合到受体菌的基因组中：连续转接5代，大部分转化子能够稳定遗传。对转化子进行了Southern杂交验证，单拷贝插入率较高，达到了83．3％；分离T-DNA插入位点的侧翼序列．，经分析得出T-DNA的插入位点是随机的，证明该体系是一个高效获得插入突变体的体系。此外，通过电击的方法转化将质粒pUCATPH转化T．1anuginosus的原生质体，转化子经PCR验证潮霉素基因已经整合到受体菌的基因组中。蛋白激酶基因pspk是我们从疏绵状嗜热丝孢菌中分离到的1种新的蛋白激酶基因，通过生物信息学分析推测其可能具有mRNA裁剪的功能，其具体的功能尚需进行研究分析。预测蛋白质的亚细胞定位信

4、息对于了解其功能有重要的意义，为分析T．1anuginosus蛋白激酶基因pspk的功能，构建了该基因与GFP基因的融合表达载体pROKII．GFP-pspk，通过农杆菌介导的方式转化洋葱表皮细胞并在其中进行表达，在荧光显微镜下进行观察，绿色荧光出现在细胞核的位置，推测该蛋白激酶在洋葱表皮亚细胞定位的部位为细胞核。为进一步分析该基因的功能，依据同源重组原理构建了敲除该基因的打靶载体pUCATPH／PK和pROKII．hygro／PK，分别用于电击转化和农杆菌介导的转化方法敲除该基因，上下游同源臂分别为739bp和737bp，为今后进行嗜热真菌疏绵状嗜热丝孢菌遗传转化体系的建

5、立及蛋白激酶定位和敲除载体的构建T．1anuginosus中蛋白激酶基因pspk的敲除，获得pspk基因缺失的突变体，研究该基因的功能提供了重要材料。关键词：Thermomyceslanuginosus；转化体系：蛋白激酶；亚细胞定位；基因敲除载体；n山东农业大学硕士学位论文AbstractThermomyceslanuginosusisathermophilicfungus、7l，imhighergrowthtemperature．ThefungusCallproducethermostableenzynes，anditssomethermostableenzymesge

6、neshavebeenclonedandexpressed．However，itisunclearaboutthemechanismhowthermophilicfungireeeptandtransfersignal．Throughgenetictransformation,exteriorplasmidinsertionintogenomerandomlytoestablishthemutantofthisfungusismeaningfidtoresearchthethermophilicmechanism．Inaddition，itmayprovidewideapp

7、licationingeneoverexpressioninthisfungusandseparatingfunctionalgene．Agrobac纪riumtumefaciens—mediatedtransformation(ATMT)嬲asimpleandefficientmethodfortransformingandinsertionalmutagenesishasbeenwidelyusedinplantsandfungi，buthasnotbeenusedinanythermophilicfungus