腈水合酶在大肠杆菌中的表达与纯化

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1、●摘要／Y㈣1肿8删3删8伽3舢舢2f『『『5脚微生物产生的腈水合酶是催化丙烯腈生成丙烯酰胺的重要生物催化剂。它的反应条件温和、产率高、副产物少、产物的自聚率低、具有区域和立体选择性，可广泛地应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。本文通过PCR扩增得到诺卡氏菌的腈水合酶基因。先是构建了BL21．pGEX．4T．1／NHase重组菌，表达GST．NHase融合蛋白。但是由于GST的相对分子质量较大，阻碍了腈水合酶的13亚基与a亚基的正确结合，从而使腈水合酶表现不出酶活。利用凝血酶对纯化后的GST-NHase融合蛋白进行酶切，酶切产物先后经GlutathioneSepharose

2、4B亲和柱和苯甲脒柱结合分别去除酶切下的GST蛋白和凝血酶，得到较纯的腈水合酶，气相色谱检测比酶活为100U／mg。之后，又构建了BL21．pET．30c／NHase重组菌，IPTG诱导表达结果显示，腈水合酶0【亚基基本上没有得到表达，影响了腈水合酶的活性。生物信息学分析发现腈水合酶a亚基的起始密码子为舀g，可能不易被大肠杆菌的RNA聚合酶识别，于是通过点突变将垂g替换成atg，阳性重组子经IPTG诱导表达结果显示腈水合酶13亚基和仅亚基的表达量都有所提高，气相色谱法检测腈水合酶的活性也有所提高，比酶活达到了200U／mg。诱导表达的菌液经超声破碎后，离心得到的粗酶液，再用EPI

3、．30．ARG．IDA．C02+亲和载体纯化带6×Histag的腈水合酶。关键词：诺卡氏菌；腈水合酶；重组质粒；诱导表达●●◆AbstractThenitrilehydratasefromMicrobialistheimportantbiologicalcatalystswithwhichascatalystacrylonitrileweresynthesizedintoacrylamide．Ithastheadvantages．Suchasmildreactionconditions，highyields，fewerby·products，thesmalllossofthepr

4、oductofSelf-Polymerization，regio-andstereoselectivityandcarlbewidelyusedinsynthesisofaminoacids，amides，carboxylicacidanditsderivatives．Inthispaper,afragmentofthenitrilehydratasegenefromNocardiawasobtainedbyPCR．TherecombinantbacteriaofBL21·pGEX-4T-1／NHasewereconstructedtoexpressthefusionprotei

5、nofGST-NHase．However,duetotherelativemolecularweightoftheGSTisalittlelargewhichhamperedthecorrectcombinationofnitrilehydrataseIB-subunitandasubunit．SothatnitrilehydrataseactivityCannotbedisplayed．ThefusionproteinGST-NHase，expressedinBL21(DE3)strain，WaspurifiedwithGlutathioneSepharose4Baffinit

6、ychromatographyfollowedbythrombincleavage．ThedigestedproductWasfurtherpurifiedwithadditionalGiutathioneSepharose4BaffinitychromatographyandBenzamidineaffinitychromatographystep．AndtherecombinantbacteriaofBL21-pET-30c／NHaseWasconstructedandwsainducedbyIPTGTheresultsshowthattheexpressionoftheQ—

7、subunitofnitrilehydratasehasnotbeenlargelyaffectedtheactivityofnitfilehydratase．Bioinformaticanalysisfoundthatnitrilehydratasethestartcodonofthea-subunitWasgtg，maybedifficulttOberecognizedbytheRNApolymeraseofE．coli．Thenbythesite-directedmutat