海洋细菌褐藻胶裂解酶在大肠杆菌中表达加工与转运及重组酶的纯化与性质研究

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1、白表达，经凝胶成像系统软件分析表明培养基中添加海水能够促进重组蛋白的表达或者增强蛋白质的稳定性。海水在前体蛋白加工上有重要的影响，添加海水能够促使蛋白前体加工成有活性的成熟蛋白。另外表达的重组蛋白分泌到细胞周质空间及细胞外环境中，而不形成包涵体，从而避免蛋白复性等许多问题。将重组表达载体pBAD—ALY转入大肠杆菌MC4100A(wt)CUl64A(SecY缺陷型)和BILKOA(Tat缺陷型)中，通过诱导表达AIyPEEC，研究蛋白的转运与加工过程。研究发现，AIyPEEC在大肠杆菌中通过Sec途径转运，转运到细

2、胞周质和培养基中，在细胞周质中的存在两种分子量的活性蛋白分别是42kDa和32kDa。细胞质中仍然存在成熟蛋白，这可能是在跨膜时，蛋白没有完全转运。通过分子筛SephadexG-75柱和离子交换层析DEAE-SepharoseFastFlow两步法纯化重组酶。纯化的重组褐藻胶裂解酶最适温度为309C，是一个热不稳定酶，在30。C时保温10min后，仍保留80％的相对酶活，而在700C保温10min后完全没有酶活。该重组酶最适pH值为7．0，在pH6．0～pH7．0之间重组的褐藻胶裂解酶比较稳定，在低于pH6．0或高

3、于pH7．0酶活明显下降。Na+、K+、M醇+、Mll2+、Ca2+和Ba2+是重组褐藻胶裂解酶激活剂，而Zn2+，Ag+和C02+起到抑制作用。螯合剂EDTA较强地抑制重组褐藻胶裂解酶活性，而螯合剂EGTA和1．10-phenanthroline较温和地抑制重组褐藻胶裂解酶活性，这说明纯化的褐藻胶裂解酶是金属酶(Ramirez-Zavalaeta1．2004)。PMSF也微弱地抑制重组褐藻胶裂解酶活性，这说明丝氨酸残基对褐藻胶裂解酶的活性中心是必要的(GeorgeandDiwan1983)。该重组褐藻胶裂解酶能够

4、裂解海藻酸钠、polyM、polyG，具有较宽的底物特异性。裂解产物为四糖到六糖的寡聚糖。关键词：褐藻胶裂解酶；多克隆抗体；重组蛋白表达；蛋白转运；蛋白加工重组蛋白纯化与性质；Expression，processingandexportofPseudoalteromonaselyakoviialginatelyaseinEscherichiaCOli,purificationandcharacterizationoftherecombinantalginatelyaseAbstracthrecentyears,ma

5、rinedrugshavebeendevelopingveryrapidly谢tllthedevelopmentandutilizationofmarineresources．Ithasbeenreportedthataligatehasmanybiologiealandphysiologicalfunctionsinhumanandhasmanyappilcationsinparmarceutical，foodandagriculturalindustries．Therefore，muchattentionhas

6、beenpaidtothealginateanditshydrolysisproducts．Especiallyoligosaceharidesfromalginatebychemicalandenzymatichydrolysishasmorebiologicalactivityandanewfunctions．However,thechemicalhydrolysisprocesshasmanydrawbacks．Therefore，manyresearchershavebeeninterestedinalgi

7、natehydrolysisbyusingalginatelyasefromdifferentsources，especiallyfrommicroorganisms．Microbialalginatelyasehasveryhighactivity,differentalginatelyasefromdifferentmicroorganismshasdifferentsubstratespecificityandmicrobialalginatelyasecanbeeasilyproducedbyferment

8、attion．nhasbeenreportedthatthemarinebacteriumPseudoalteromonaselyakoviiwhichwasisolatedfromadecayingthallusofLaminariaisapathogenofLaminarm．Interestingly，theextracellularalginately