海洋细菌（agarivorans+albus+ykw-34）产生褐藻胶裂解酶及琼胶酶的研究

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1、中国海洋大学博士学位论文海洋细菌（AgarivoransalbusYKW-34）产生的褐藻胶裂解酶及琼胶酶的研究姓名：付晓婷申请学位级别：博士专业：食品科学指导教师：林洪20080701海洋细菌(AgarivoransalbusYKW-34)产生的褐藻胶裂解酶及琼胶酶的研究摘要从韩国东海岸的蝾螺(Turbinidaebatilluscornutus)肠道中筛选出的菌株YKW-34，能够有效降解一些褐藻和红藻的细胞壁多糖。通过分析其16SrRNA基因序列，将该菌株鉴定为Agarivoransa／bus，命

2、名为AgarivoransalbusYKW-34(中文名暂定为白色琼胶贪食菌YKW-34)。A．albusYKW-34在其生长培养基marinebroth中不产生多糖降解酶；但在以多糖作为碳源的培养基中可产生1种褐藻胶裂解酶和2种琼胶酶。本研究旨在对A．a／busYKW-34产生的褐藻胶裂解酶和琼胶酶进行生产优化、分离纯化、性质研究及基因克隆，以便为两种酶的工业化应用提供理论依据和实践基础。．通过单因子和正交实验，对A．a／busYKW-34产褐藻胶裂解酶的培养条件进行了优化。结果表明，其最适碳源为海带

3、粉O．5％(w／v)，氮源为KN030．1％(w／v)，最佳种龄为12h，接种量为10％，最适培养基初始pH值为8．0，培养温度为250C。在上述条件下，l10rpm震荡培养48h，褐藻胶裂解酶产量达到最大值5U／ml。在发酵培养基中添加过量的多糖或单糖可抑制产酶；增加氮源的浓度或种类有利于菌株的生长，但也会抑制产酶。通过聚醚酰亚胺沉淀，阴离子交换．、疏水及凝胶过滤色谱，进行了A．a／busYKW-34产褐藻胶裂解酶的纯化。其回收率为7％，纯化倍数为25倍。SDS-PAGE和凝胶过滤色谱表明此酶由单一肽

4、链组成，分子量为60kDa。等电聚焦实验表明其等电点为5．5．5．7。此酶的最适pH为7．O，在pH7．0-10．0稳定；最适温度为30-400C，低于500C时稳定。此酶具有钠／钾离子依赖性。透析除去反应体系中钠，钾离子后，酶活力丧失；添加钠，钾离子后，酶活力可完全恢复。此酶对还原剂如p．巯基乙醇和DTr、金属离子络合剂如■EDTA和EGTA具有耐受性；变性剂如SDS和尿素可使酶活力提高30％。底物专一性实验表明，此酶能同时降解甘露糖醛酸和古罗糖醛酸片断。通过单因子实验、Plackett-Burman

5、设计及响应面设计实验，对A．a／busYKW-34发酵产琼胶酶的条件进行了优化。单因子实验表明，最佳碳源和氮源分别为琼胶和酵母浸膏，最适培养温度为250C。在此条件下，确定最适培养时间为12h。Plackett-Burman设计表明琼胶、酵母浸膏及初始pI-I三个因素对琼胶酶产量具有显著影响(尸．<0．05)。响应面设计实验确定此三个因素的最适水平为：琼胶0．23％，酵母浸膏0．27％，初始p_H为7．81。经优化后，琼胶酶产量由0．23U／ml提高至0．87U／ml。用活性染色法对琼胶酶进行了原位测定

6、，结果表明，琼胶酶为培养液中的主要蛋白质组分，其分子量约为50kDa。离子交换色谱表明，A．albusYKW-34能产生两种琼胶酶，将其分别命名为AgaA34和AgaB34，其中AgaA34产量为747U／I，AgaB34产量为83U／1。AgaA34进一步通过凝胶过滤色谱得以纯化。SDS-PAGE和凝胶过滤色谱表明此酶由单一肽链组成，分子量为50kDa。纯化的回收率为7％，纯化倍数为25倍。经测定，AgaA34的N端氨基酸序列为ASLVTSFEEA，与糖基水解酶家族50的琼胶酶相似；AgaB34的N端

7、氨基酸序列为ADWD舳IPAELDAG，与糖基水解酶家族16的琼胶酶相似。AgaA34的酶学性质分析表明，此酶的最适pH为8．0，在pH6．0．11．0稳定；最适温度为400C，在温度≤500C时稳定。MALDI．TOFMS和13CNMR分析表明AgaA34的琼胶酶解产物为75m01％新琼二糖和25m01％新琼四糖。薄层色谱表明此酶能将新琼四糖降解为新琼二糖。以琼脂糖和新琼四糖为底物，此酶的催化效率分别为4．04x103和8．1x102s-1盯1。海水中的常见金属离子对AgaAa4的酶活力无显著影响。此

8、酶对SDS和尿素具有耐受作用；p．巯基乙醇和D1T可提高酶活力。本研究建立了A．albusYKW-34的基因组文库，并从此文库中克隆出琼胶酶基因(agaB34)。此基因长1362bp，编码453个氨基酸。根据同源性分析，判断其氨基酸序列1-23aa为信号肽，25．297aa为糖基水解酶家族16催化组件，316-452aa为碳水化合物结合组件。成熟蛋白的分子量预测为48，637Da，等电点预测为6．34。通过构建N端包含信号肽序列及C端镶嵌6