海洋溶胶细菌flammeovirga sp.my04琼胶酶(系)的研究

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1、中国海洋大学博士学位论文海洋溶胶细菌Flammeovirgasp.MY04琼胶酶（系）的研究姓名：韩文君申请学位级别：博士专业：药物化学指导教师：顾谦群；李越中201206海洋溶胶细菌月日m肌Pov垤口sp．MY04琼胶酶(系)的研究海洋溶胶细菌砌珊肌卯砌舶sp．MY04琼胶酶(系)的研究摘要海洋细菌用口所朋PDv西酗sp．MY04能直接液化琼脂糖，生成水溶性低聚糖和寡糖，具备用于固相发酵的潜力。因此，MY04是1株高效的琼胶酶资源菌，具有良好的应用价值和开发意义。本文先后通过MY04胞外琼胶酶系的分析、基因文库的构建与琼胶酶基

2、因的筛选，及基因组的测序与琼胶酶系的分析，进行了用口聊聊PDv打I渺sp．MY04琼胶酶资源的初步发掘，分析了菌株具有溶胶能力的遗传学基础。本文还系统地研究了琼胶酶AgaG4的酶学性质、新颖结构的功能与相关机制。结果如下：1．MY04胞外琼胶酶系的基本特征分析在无琼脂糖底物的培养条件下，获得了MY04的胞外粗酶，证明胞外琼胶酶系由至少4条琼脂糖降解酶组成，分子量大小约30kDa一70kDa，整体上具有耐中等高温(0℃一50℃)、耐碱(pH仁10)和耐盐(0M—0．9M)的特性。经寡糖产物的纯化、阳离子质谱和13C．谱分析，将胞外

3、酶降解琼脂糖后的主产物鉴定为新琼四糖、新琼六糖，间接证明MY04的胞外琼胶酶系是伊琼胶酶系。2．MY04基因组DNA文库的构建与琼胶酶的基因筛选、分析以pCClFos为载体，在E．∞，fEPl300中构建了MY04的基因组DNA文库，平均插入片段约30kb_-36kb，覆盖约15Gbp的MY04基因组DNA。对文库进行的活性筛选没有获得任何琼胶酶基因。最后，通过文库中随机克隆插入片段末端的测序与分析、文库的PCR筛选与阳性质粒pAl2的鸟枪法测序，获得了1个编码GHl6家族伊琼胶酶的基因唧G4。琼胶酶AgaG4由503个氨基酸残

4、基组成，序列中含有在GHl6家族伊琼胶酶中保守的8个糖基结合位点、2个催化位点和3个Ca2+结合位点。AgaG4具有模块化的组成特征，包括N．端信号肽、1个GHl6模块、1个富含Glv．／Ser-残基的链接区、1个推定的碳水化合物结合模块和1个与膜定位相关的模块。这些功能模块的组成方式有两个新颖之处：一是GHl6模块中含有不常见的由连续57个氨基酸(N246一G302)组成的肽段；二是C．端非催化结构域由可归类于CBM2或CBM5家族的几丁质结合域(ChtBD3)、p卯分泌系统膜整合结构域组成，这是琼胶酶一个新颖的模块化组织方式

5、。系统发育分析表明，AgaG4与F朋P粥mP淞西YT的伊琼胶酶AgaYT、蚴c加scf如Sp．PI也1推定的∥．琼胶酶MSll6，构成GHl6家族伊琼胶酶的一个亚家族分支。中国海洋大学博士学位论文3．琼胶酶AgaG4的异源表达、酶学鉴定，及其特殊模块结构的功能、机制分析(1)琼胶酶AaG4的异源表达、重组酶制备与性质鉴定用质粒pBAD／gIIIA在E．cD，fTOPl0菌株中表达了基因唧G4，菌体中重组蛋白rAgaG4的表达量大于200m∥mL，含量接近30％。通过包涵体的纯化、变性溶解，及重组蛋白的Ni．亲和层析、复性，获得纯

6、度大于97％的重组蛋白rAgaG4。复性后的rAgaG4具有专一的琼胶酶活性，酶活144U／mg，最适温度为50℃、最适pH为7．5，在O℃一50℃、pH6．9的范围内分别具有热稳定性和酸碱耐受性。重组酶rAgaG4在降解琼脂糖时表现为内切型降解模式。本章还建立了不依赖于13C．谱分析的琼寡糖、新琼寡糖的MS／MS鉴定方法，将两个寡糖终产物分别鉴定为新琼四糖、新琼六糖。这表明，尽管AgaG4与F弦哆妒聊P脚西YT的琼胶酶Ag小仃具有98％的序列一致性，但它们的琼脂糖降解产物不同，因而是功能不同的琼胶酶。本文的深入研究还通过寡糖总

7、产物的荧光标记、HpLC分析，测定寡糖终产物中新琼四糖、新琼六糖的摩尔浓度之比是1．5：1，且总含量大于99％；测得寡糖总产率为72％一78％。重组酶rAgaG4的最小降解单元是新琼八糖，最小寡糖产物是新琼四糖。而且，在rAgaG4降解新琼十糖时，新琼四糖产生自非还原性末端。综上，琼胶酶AgaG4是热稳定的、内切型GHl6家族伊琼胶酶，在新琼四糖与新琼六糖的专一性制备中具有良好应用前景。相对单一的琼脂糖、寡糖降解方式提示，AgaG4具有严谨型的底物降解机制。(2)琼胶酶AgaG4特殊模块结构的功能分析用PCR技术对qg口G4基因

8、进行了截短改造，获得截除了AgaG4中C一端非催化结构域的编码序列、仅编码GHl6模块的基因截短体唧G4．GHl6，以及截除AgaG4的GHl6模块中特殊肽段编码序列的基因截短体昭口G4．T57。按照与基因唧G4同样的研究方法，分别获得纯度大于95％的重组蛋白截