β-琼胶酶的纯化及新琼二糖水解酶agwh117a结构的研究

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1、万方数据13一琼胶酶的纯化及新琼二糖水解酶AgWHl17A结构的研究学位论文答辩日期：指导教师签字：答辩委员会成员签字：／砌、无／夕∥匕飞涑轧Z‰是，／／≥—矶万方数据谨以此论文献给我尊敬的导师，以及实验室全体老师和同学!一⋯一一～一杨孟万方数据独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特另tlDn以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得!洼；麴遗查墓丝盖要鉴别重明的：奎拦卫窒2或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。

2、与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：帮阢k签字日期：7．1)f．．t-mX-月27日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：1．学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。2．学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识

3、资源总库》，授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：签字日期知心年上月M日导师签字：签字隰加瞬岁月巧日万方数据B一琼胶酶的纯化及新琼二糖水解酶AgWHI17A结构的研究摘要琼胶酶是一类能够降解琼胶生成琼胶寡糖的酶。根据断裂方式的不同可分为Ot．琼胶酶和p．琼胶酶。琼胶酶的应用非常广泛：可作为工具酶分离海藻中的原生质体；回收琼脂糖凝胶中DNA和分析海藻细胞壁中多糖成分。另外琼胶酶降解琼脂产生的琼胶寡糖由于其显著的生物学活性，在食品和

4、医药领域也有广泛的应用。本文从青岛近海的红藻中筛选得到一株高产琼胶酶菌株，并通过发酵优化之后，分离纯化得到2种功能良好的B．琼胶酶；同时对本课题组表达成功的新琼二糖水解酶AgWHll7A进行了结晶以及结构解析。主要研究内容及结论如下：(1)从青岛近海红藻类以及印尼海泥中筛选得到了6株海洋产琼胶酶菌株。经过16SrRNA测序鉴定，确定其分别属于Pseudoalteromonassp．、Agarivoransalbus．、所6砌彪刀砒s和Microbulbifersp．，并对其中产琼胶酶活性高的菌株进行了菌株鉴定其为Ag

5、arivoransalbus，并命名其为AgarivoransalbusOAY2。为提高OAY2菌株的产酶量，对发酵培养基进行了优化。确定其最佳优化条件为蛋白胨0．49g／L，酵母粉1．08g／L，pH9．85。酶活由原来的1．06U／mL提高到2．65U／mL。(2)从AgarivoransalbusOAY2发酵液中，纯化得到了2个B．琼胶酶，分别命名为琼胶酶a和琼胶酶b。发酵液经硫酸铵分级沉淀，硫酸铵饱和度为60％时，酶获得最佳比活。优化蛋白纯化条件，发现琼胶酶a在20mM，pH6．0的磷酸盐缓冲液中经DEAE柱

6、子可以得到纯度较高的蛋白；琼胶酶b在20mM，pH7．0的Tris．Hcl缓冲液中经强阴离子交换柱Q柱，可以达到纯度较高的蛋白。琼胶酶a和b纯化之后的回收率分别为0．16％和0．09％，比活由原来的25．26U／rag分别提高到了2715U／mg和1338U／mg。琼胶酶a，b的分子量分别为50kDa和107kDa。琼胶酶a的最适温度与pH分别为40。C和9．0，琼胶酶b的最合温度与pH为50。C和9．0。Cu2+，C02+，Mn2+对琼胶酶a，b有很大的抑制作用，而DTT对这两个酶有很大的促进作用。13C-NMR和

7、TLC结果显示琼胶酶a的主要产物是新琼二糖(NA2)，新琼四糖(NA4)和新琼六糖(NA6)。琼胶酶b的只要产物是八糖以上的糖，但是它也可长时间反应生成NA2。根据基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI．TOF．TOF／MS)结果显示，琼胶酶a属于糖苷水解酶(GH)1l8家族，万方数据琼胶酶b属于GH50家族。(3)新琼二糖水解酶AgWHl17A能够降解新琼寡糖生成琼寡糖和内醚半乳糖，是微生物代谢琼脂的关键酶之一，也是生产奇数琼寡糖和内醚半乳糖的重要工具酶。经过x．射线衍射得到新琼二糖水解酶AgWH17A的三维

8、结构。对比NCBI数据库中有结晶的蛋白质氨基酸序列为a-NABH(SaccharophagusDegradans2-40)其相似性最高的为74％。活性位点关键氨基酸其同为广义碱Asp52．Asp207和广义酸Glu207。在AgWH17A的三维结构中，一个不对称单元有两个分子，空间位置是p21位，推测其催化机制是保留机制。利用“TK．SA”模型