青岛近海产琼胶酶菌株的筛选鉴定

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1、青岛近海产琼胶酶菌株的筛选鉴定海洋生态系统中存在仃大屋的产琼胶爾的细菌O迄今为止，我们已经从海水、海洋沉积物以及其它环境中发现的不同菌属里分离到了儿种琼胶酶口琼胶降解菌株通过一系列的琼胶酶实现対琼胶的降解利用。不同的琼胶降解菌株能够分泌产生不同的琼胶酶.不同的琼胶酶降解琼胶乂形成不同的降解产物。因此，琼胶降解菌株的广泛筛选倚助于对新型琼胶酶的筛选和开发利用。本章节我们利用琼胶为唯一碳源,从青岛近海海域的海草样品中筛选分离到6株海洋琼胶降解细菌。分别对6株海洋菌株进行发酵培养,采用DNS法测得了它们的琼胶酶活性•并克隆其WSrDNA序列，进行分子鉴定并测得了部分生理生化特征

2、指标°2.1实验材料2.1.1实验试剂琼脂粉AR上海蓝季生物发展有限公司蛋白淼AR夭津市大茂化学试剂厂酵母粉AR安琪酵母股份何限公司半乳稱AR国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠AR夭津市河东区红岩试剂厂磷酸二氢钾AR济南试剂总厂3,5—二硝基水杨酸BR国药集团化学试剂有限公司苯酚AR犬津市博迪化工何限公司酒石酸钾钠AR国药集团化学试剂有限公司业硫酸氢钠AR上海试I川赭维化工仃限公司磷酸二氢桜AR天津市广成化学试剂有限公司匍萄輔AR犬津厂成化学试剂厂无水亚硫酸钠AR夭津市大大化丁实验厂AR夭津北方犬医化学试剂厂盐酸AR天津市大茂化学试剂厂硫酸二乙酣AR夭津广成化学试剂厂澡百里

3、酚蓝AR夭津北方犬医化学试剂厂乙醉AR夭津市广成化学试剂有限公司苯酚红AR夭津光复精细化工研究所法卩酚紫AR夭津光复精细化匸研究所氯仿AR夭津市广成试剂有限公司蔗椭AR江苏强盛化工自限公司麦芽糖BRI二海强顺化学试剂有限公司*蔡酚AR上海生工生物仃限公司丙酮AR天津市北方天医浓盐酸AR天津巴斯夫化工过眾化氢AR犬津巴斯夫化工酚红AR大津巴斯夫化工实验所用到的主要实验药品如上所示•所用主要实验试剂的配制如卜:革兰氏碘液：称取*2.2g,碘化钾4.4g用少虽水使碘完全溶解，然后定容至lOOmLr：于棕色瓶叽磷酸缓冲液(pH7.6)：3.4gKH2PO4?ff-f212mL0.

4、1mol/L的NqOH溶液中,定容到500niLoDNS试剂：3.15g的3,5■二硝基水畅酸溶于131mL2moSnLNeOH溶液屮，再与250mL含有91g酒石酸钾钠的热水混合。向该溶液中加入2.5g苯酚和2.5gNa3SO3＞在50°C水浴中搅拌溶解。再用蒸镉水稀释到500mL,存放7d后再用。2.1.2实验仪器实验所用到的上要仪器设备如下所示。仪器名称型号生产单位分光光度计7200尤尼柯上海仪器有限公司电子夭平BS124S赛多利斯科学仪器有限公司托盘天平3924北京大栅栏夭平厂生化培养箱SPX宁波江南仪器厂立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-50KA上海中安医疗器械厂电热

5、恒温鼓风「燥箱DHG-9140A上海精宏实验设备有限公司离心机TGL-16B上海安亭科学仪器厂大容星恒温培养摇床DXHY-2000M长沙湘仪离心机仪器仃限公司洁净工作台SW-59-278上海礴迅实业仃限公司恒温培养箱CBIO-UVI北京赛存奥科技仃限公司恒温水浴锅DK-9S-1熨大津市泰斯特仪器有限公司PCR仪PTC-11-18宝生物数码凝胶成像仪GIS-2008大能科技有限公司2.1.3培养基2216E海洋细菌液体培养基:蛋白腺5g,酵母粉1g,柠棣酸铁0.01g,陈海水1000mL,pH=7.2-7.6：发酵培养以为液体培养基添加0.4%的琼脂：固体培养基为液体培养基

6、添加1.6%的琼脂。糖醉发酵试验培养基：MgSO40.2g：(NH4)2HPO41g:酵母汀0.2g：KC10.2g：浓度为1%椭(衙萄糖、麦芽衲、蔗糖、乳糖、F乳椭)：琼脂6g：蒸懈水1000mL,pH7.0a屮基红试验培养基：蛋白腕5g：NaC15g：fiii萄糖5g：蒸他水lOOOmL：pH7.0oV・P实验培养基：蒸诩水1000tnL：蛋白豚5g：NaC15g：衙萄糖5g：pH70菌膜试验培养基:蒸馆水lOOOmL：蛋白腺5g：牛肉膏10g：氯化钠5g：pH7.2o尿酶试验培养基:蛋白腺1g:匍萄椭1g:NaCl5g:酚红0.012g：KH2PO42g：琼脂15g

7、：蒸馆水1000niL・2.2实验方法2.2.1琼胶降解细葡的筛选取栈桥附近海域中海草样品,迓于适址无菌生理盐水中充分震荡,梯度稀释后.涂布在固体培养基表面.28°C恒温培养1-3cl.观察.能够降解琼胶的细菌，其菌落周围会产生凹陷或透明区域。将初筛分离纯化得到的产琼胶酶菌株分别接种到斜面和平板培养基中28°C培养，4Sh后对平板培养基中生长出的菌落进行卢戈氏碘液染色，琼胶平板被染成深褐色,琼胶降解菌株的周围由于琼胶彼降解而不能着色,因此会产生透明圈,挑取菌落周围透明圈明显的菌株平板划线纯化至单菌落。-80°C甘油管保藏菌种。