螺旋藻激酶的分离纯化和酶学性质研究

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1、广西医科大学硕士学位论文螺旋藻激酶的分离纯化和酶学性质研究姓名：陈高斯申请学位级别：硕士专业：生理学指导教师：庞辉20100501螺旋藻激酶的分离纯化和酶学性质研究硕士研究生学位论文摘要目的研究螺旋藻激酶的分离纯化方法，为工业化放大生产螺旋藻激酶药物提供一定的实验依据，为后续的酶学性质研究打下基础。研究螺旋藻激酶的酶学性质，为螺旋藻激酶的保存、运输等条件和开发成溶栓药物提供一定的参考依据。方法1．螺旋藻激酶的分离纯化：(1)确定以纤维蛋白平板法作为检测螺旋藻激酶活力的方法，绘制标准曲线。(2)确定以考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的方法，分别做灵

2、敏度为10099／mL和lOp,g／mL的标准曲线。(3)螺旋藻激酶粗酶液制备蒸馏水浸泡螺旋藻激酶发酵提取物粉剂，搅拌均匀后4。C下静置过夜，弃去沉淀，上清液即为螺旋藻激酶粗酶液。(4)硫酸铵分级盐析设定6个馏分，盐析后分别收集上清液和沉淀，检测酶活力，根据相对活力与硫酸铵饱和度绘制盐析曲线。(5)透析处理透析袋，盐析产物装袋后置于蒸馏水中浸泡，隔l、2、4h换水，最后透析过夜。(6)凝胶过滤层析装SephadexG．75凝胶层析柱，将透析所得螺旋藻激酶液上柱，以PBS缓冲液洗脱，以紫外280nm检测同步检测洗脱液，收集各穿透峰，并用纤维蛋

3、白平板法检测有无活力，收集有活力的穿透峰。(7)SDS．PAGE电泳安装垂直电泳槽，制备凝胶，以SDS．PAGE电泳法验证螺旋藻激酶纯度，测定分子量。2．螺旋藻激酶的酶学性质研究：(1)螺旋藻激酶的最适温度将螺旋藻激酶点入纤维蛋白平板的小孔中，将纤维蛋白平板置于不同的温度中保温，测溶圈大小，以最高酶活力为100％，计算各温度点螺旋藻激酶的相对活力，螺旋藻激酶的分离纯化和酶学性质研究硕士研究生学位论文以温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标，得出螺旋藻激酶反应的最适温度。(2)螺旋藻激酶的温度稳定性取6管螺旋藻激酶溶液，置于不同的温度下保温，每隔3

4、0min取样，取出的酶液立即置于．20℃下冷冻保存，最后将所有样品同时在一个纤维蛋白平板上测定活力，以最高酶活力作为100％，求相对活力，以温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标，得出螺旋藻激酶的温度稳定性结果。(3)螺旋藻激酶的最适pH配制一系列的pH浓度范围为pH4,--pHl2的缓冲液，将纤维蛋白平板切割成小块，浸泡其中过夜以使胶块内液体与缓冲液充分交换，以测得37。C下螺旋藻激酶的最高活力为100％，求相对活力，以pH为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，找出螺旋藻激酶反应的最适温度。(4)螺旋藻激酶的pH稳定性配制一系列pH浓度范围为pH4

5、～pHl2的缓冲液，将螺旋藻激酶分别采用上述不同pH值的缓冲液溶解，以测得37"C下螺旋藻激酶的最高活力为100％，求相对活力，以pH为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，得出螺旋藻激酶的pH稳定性结果。(5)螺旋藻激酶的作用方式取一块纤维蛋白平板，切取一半出来于85℃下保温30min，另一半不做处理。在两块平板上皆点样螺旋藻激酶和尿激酶，同时放入37℃培养箱中保温，观察效果。(6)抑制剂和变性剂对酶活力的影响按一定比例分别配制螺旋藻激酶和抑制剂和变性剂的混合液，以蒸馏水和螺旋藻激酶的混合液为对照，37℃下保温1h测活力。结果1．螺旋藻激酶的分

6、离纯化：(1)螺旋藻激酶粗分离制备螺旋藻激酶粗酶液，经硫酸铵分级盐析，通过绘制盐析曲线，确定采用45％饱和度硫酸铵沉淀除去杂蛋白，再用75％饱和度硫酸铵沉淀收集该酶，经透析后冷冻干燥保存。(2)凝胶过滤层析洗脱分离出洗脱峰，以纤维蛋白平板法检测各洗脱峰活力，其中只有第2个洗脱峰有活力，其余洗脱峰均检测不到酶活力，收集此峰洗脱液。(3)SDS．PAGE结果杂蛋白基本被除尽，得到单一的螺旋藻激酶蛋白带，所得螺旋藻激酶的分子量为40KD。2．螺旋藻激酶的酶学性质研究：(1)螺旋藻激酶的最适温度螺旋藻激1螺旋藻激酶的分离纯化和酶学性质研究硕士研究生

7、学位论文酶在45。C时活力最高，为其最适温度，45℃一55。C是其最适反应温度范围。(2)螺旋藻激酶的温度稳定性在50。C以下时，螺旋藻激酶的半衰期都在1h以上，热稳定性强。(3)螺旋藻激酶的最适pH螺旋藻激酶最适反应pH为8，最适pH值范围为pH8～pH9。(4)螺旋藻激酶的pH稳定性螺旋藻激酶在pH6～pH10的范围内稳定性较强，pH9的时候酶活力最高，低于pH6或超过pH10，稳定性较差，说明螺旋藻激酶应在偏碱的环境下保存。(5)螺旋藻激酶的作用方式螺旋藻激酶溶解纤维蛋白的作用方式与尿激酶不同，螺旋藻激酶具有直接降解纤维蛋白的作用。(

8、6)抑制剂和变性剂对酶活力的影响证明螺旋藻激酶是一种丝氨酸蛋白酶，结构中不含二硫键。结论螺旋藻激酶样品经过两级硫酸铵盐析和SephadexG．75凝胶层析后，酶回收率达到42．3