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《酵母SOD分离纯化及其酶学性质的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、收稿日期:2004-6-16作者简介:苏昕(1966-),女(汉族),辽宁沈阳人,讲师,硕士,主要从事微生物与生化药学研究,Tel.024-23843711-3513,E-mailsuxin660511@sina.com。文章编号:1006-2858(2005)01-0067-04酵母SOD分离纯化及其酶学性质的研究苏昕,阎浩林,梁丽莉(沈阳药科大学制药工程学院,辽宁沈阳110016)摘要:目的发酵培养Y12酵母菌分离制备酵母SOD并研究其部分酶学性质。方法用已筛选出的一株Y12酵母菌对其在优化培养条件下发酵培养得到湿菌体,破壁抽提得SOD粗酶液,采用硫铵盐析、丙酮沉淀、Sepha
2、dexG-100凝胶过滤和QAE-SephadexA-50离子交换柱层析,分离得到酵母SOD并测定其部分酶学性质。结果Y12酵母菌SOD产量达1263u#g-1湿菌体,分离得到酵母SOD,该酶属Cu、Zn-SOD,比活力为107315u#mg-1,活力回收率为5411%,紫外吸收峰在25712nm,分子质量为32456u,亚基分子质量为16227u。结论此酵母SOD与文献中报道的动物血红细胞Cu、Zn-SOD基本相近。关键词:酵母SOD;分离纯化;酶学性质中图分类号:Q554文献标识码:A超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)是一种含有铜、锌、铁、锰的新型
3、金属酶,1969年由Mccord和Fridovich发现其能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应而命名[1]。SOD是机体内的唯一以超氧阴离子为底物的酶,能维持细胞内氧自由基处于无害低水平状态,是进行需氧代谢的生物维持生存所必需的酶。由于SOD广泛存在于生物界,能专一清除超氧阴离子自由基,已引起国内外生化界和医药界的极大关注。近年来,国外利用微生物发酵生产SOD的相关报道很多[2]。其中发酵法生产SOD是一条经济可行的途经[3]。酵母菌作为生产SOD的材料来源之一,具有繁殖快,代谢时间短,产率高,易培养,易大规模工业化生产,不受季节与自然条件的限制等优点。故作者以酵母菌作为实验材料,
4、探索出一种发酵法制备SOD的途径,为今后生产奠定必要的技术基础。1材料与仪器111菌种酵母Y12(本实验组经粗筛得到的高产菌株,中国科学院沈阳生态所微生物菌种保藏室提供)。112培养基斜面培养基:8bBe麦芽汁琼脂培养基;优化培养基(液体种子及发酵用):酵母膏1g、蔗糖2g、酒石酸铵2g、Fe3+(0101mol#L-1)1mL、8bBe麦芽汁5mL,溶于100mL蒸馏水中,调pH值为5,115e灭菌20min。113药品邻苯三酚(分析纯,浙江省温州市瓯海精细化工公司),QAE-SephadexA-50(瑞典Pharmacia进口分装,上海化学试剂采购供应站试剂厂),Sephdex
5、G-100(瑞典Pharmacia进口分装),牛血清白蛋白(上海丽珠东风生物技术有限公司),低分子质量标准蛋白质(分子质量14400~97400u,中国科学院上海生物化学研究所监制),标准SOD酶(3000units,美国Sigma公司),其他试剂均为分析纯。114仪器PHS)2B型数字酸度计(上海雷磁仪器厂),HZQ)CHYA恒温摇瓶机(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司),UV)9100紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司),DYY)Ó2稳压稳流电泳仪(配有垂直板型电泳槽,北京市六一仪器厂),GL)16G)Ò冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。2方法与结果211菌种部分菌种酵母
6、Y12经斜面培养基活化2次,每次培养48h,转入优化种子液体培养基中培养15h,再转入发酵培养基中培养15h,温度均为28e,第22卷第1期2005年1月沈阳药科大学学报JournalofShenyangPharmaceuticalUniversityVol122No11Jan.2005p167对发酵液离心4000r#min-1,20min得湿菌体,水洗2次后称量,得到湿菌体量为每瓶30mL发酵液115g,菌体经超声波法破壁得粗酶液[4],酶活力为126310u#g-1湿菌体。212Y12酵母SOD酶的分离纯化由/2110条的粗酶液经硫胺盐析(017倍饱和度,12000r#min-
7、1离心10min),丙酮沉淀(018倍丙酮,12000r#min-1离心10min),得SOD样品,用5mL蒸馏水溶解后,经SephadexG-100凝胶过滤柱层析。层析柱:116cm@90cm;洗脱液:蒸馏水;流速:0125mL#min-1;每管3mL。整个柱层析实验在低温实验室中操作,经对收集的每管进行酶活力测定[5](酶活力单位定义:在1mL反应液中,将每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量,定为一个酶活力单位,即325nm01030OD#min-1为一个活
