结核分枝杆菌rv2450c基因的克隆和原核表达

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1、结核分枝杆菌Rv2450c基因的克隆和原核表达李立青，苏明权，李立文，郝晓柯【关键词】分枝杆菌CloningandprokaryoticexpressionofMycobacteriumtuberculosisRv2450cgene　　【Abstract】AIM:ToexploretuberculosisRv2450cgenecanpromoteitsotuberculosiseDNAers,clonedintoBamHⅠandEcoRⅠsiteofpGEX4T2expressionvectorandconfirmedb

2、ysequencing.AftertherebinantexpressionvectorbeingtransformedintoE.coliBL21（DE3）,therebinantbacteriaplifiedonstratedthattheRv2450countedto22.9%oftotalbacteriaprotein．CONCLUSION:MycobacteriumtuberculosisRv2450cgeneissuccessfullyclonedandexpressedinE.coliBL21（DE3）.　

3、　【Keytuberculosis;resuscitationpromotingfactor;cloning,molecular;geneexpression　　【摘要】目的：研究结核分枝杆菌Rv2450c基因是否能促进其复活和生长.方法：培养结核分枝杆菌，提取其基因组，PCR扩增出Rv2450c基因，克隆入pSP73载体，测序分析.将该目的基因亚克隆入pGEX4T2表达载体，测序证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3），30℃用IPTG诱导5h然后进行SDSPAGE分析.结果：测序结果证实获得了Rv2450c基因，其序

4、列与GenBank中报道完全一致.SDSPAGE分析表明，Rv2450c基因在大肠杆菌BL21（DE3）中表达了重组蛋白，表达的蛋白量约占菌体蛋白的22.9%.结论：成功克隆了结核分枝杆菌Rv2450c基因，并在大肠杆菌中获得了高效表达.　　【关键词】分枝杆菌，结核；促进复活因子；克隆，分子；基因表达　　0引言　　目前世界人口的三分之一被结核分枝杆菌感染，其中大部分为潜伏性感染，当机体抵抗力下降时，休眠的结核分枝杆菌即活化，引发结核病.在这个过程中结核分枝杆菌分泌的促进复活因子（resuscitationpromotin

5、gfactor,RPF）起了重要作用，但其具体机制还不清楚〔1，2〕.结核分枝杆菌H37Rv基因序列中Rv0867,Rv1009,Rv1884c,Rv2389c和Rv2450c基因均编码RPF样蛋白，它们同源性很高，是Mr约为16000的分泌蛋白.我们克隆表达了Rv2450c基因，为进一步研究其活性奠定了基础.　　1材料和方法　　1.1材料　　大肠杆菌TOP10，BL21（DE3）为第四军医大学西京医院检验科保存；原核表达载体pGEX4T2购自Pharmacia公司；质粒提取试剂盒购自Sigma公司；克隆载体pSP73、

6、胶回收试剂盒购自Promega公司；BamHⅠ,EcoRⅠ等限制性内切酶和PyrobestDNA聚合酶、T4DNA连接酶、IPTG等购自Takara公司.　　1.2方法　　1.2.1PCR引物设计根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列（登录号：NC_000962），设计引物，上游引物为5＇GAAAGGATCCACGATGAAGAACGCCCGTAC3＇，下游引物为5＇TTTGAATTCTTTTGCGTCTTTTCGCGGTGGTCAG3＇，在上、下游引物5＇端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点和3个

7、保护碱基，以便于酶切和克隆，引物由上海生工生物工程有限公司合成.　　1.2.2结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA的提取刮取适量H37Rv菌落，TE（pH8.0）洗涤后重悬，加SDS至终浓度10g/L，蛋白酶K至终浓度0.1g/L,55～60℃水浴过夜，分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）、氯仿：异戊醇（24∶1）各抽提1次，上层水相加2.5倍预冷的无水乙醇和1/10体积3mol/L乙酸钠后置-20℃冰浴1h沉淀DNA，用无水乙醇、700mL/L乙醇先后洗涤沉淀2次，抽干后溶于适量ddH2O中.　　1.2.3Rv

8、2450c基因扩增及克隆和鉴定以H37Rv基因组DNA为模板用PyrobestDNA聚合酶进行热启动PCR，循环参数为94℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸60s，30个循环后再72℃延伸10min.12g/L琼脂糖凝胶电泳观察分析扩增结果，切胶、用胶回收试剂盒纯化DNA，进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，