单纯疱疹病毒糖蛋白G重组基因片段的克隆表达、纯化及其检测试剂的初步应用

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1、南京医科大学硕士学位论文单纯疱疹病毒糖蛋白G重组基因片段的克隆表达、纯化及其检测试剂的初步应用姓名：王洁申请学位级别：硕士专业：分子流行病学指导教师：张云;李越希20030420南京医科大掌司￡士掌位论文单纯疱疹病毒糖蛋白G重组基因片段的克隆表达、产物纯化及其检测试剂的初步应用摘要单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus，HSV)分为I型(HSV一1)和II型(HSV一2)两个血清型，无论是发展中国家还是发达国家，HSV的自然感染率都相当高。I型感染与单纯疱疹病毒性脑炎(herpessimplexencephalitis，HSE)有关，且病势凶险，预后较差；而II

2、型感染与生殖道炎症及胎儿畸形有关。两型感染早期抗病毒治疗均有效，因此需要建立HSV感染的一种早期、快速、敏感和特异的诊断方法。目前实验室确定HSV感染的主要方法是免疫学检测，其中型特异性IgM抗体的检测可用于HSV急性感染的早期诊断。病毒糖蛋白G是抗HSV体液免疫应答的主要靶位，可作为HSV型特异性血清学诊断(抗体检测)的标准抗原。因此，为了建立一种敏感、特异、快速的HSV血清学检测方法，我们进行了如下研究工作：第一部分：I型单纯疱疹病毒糖蛋白G重组基因片段的克隆及其在细菌中的高效表达通过生物软件分析I型单纯疱疹病毒糖蛋白G的氨基酸序列，筛选出HSVl一gG蛋白中优势抗原决

3、定簇，采用PCR技术扩增含强抗原决定簇较集中的基因片段。PCR产物纯化后用BamHI和EcoRI双酶切，电泳回收后与用上述双酶切割并电泳回收的pGEX．4T-2质粒连接，获得的重组质粒转化大肠杆菌TGl感受态细胞。PCR鉴定可扩增出与目的片段大小一致的DNA片段。同时提取重组质粒进行DNA序列测定与比对分析，结果证实DNA插入序列正确。对构建的重组3-．程菌用IPTG进行诱导表达，SDS—PAGE电泳分析显示HSVl一gG特异性表达产物的分子量约为43．5kD，表达量占菌体蛋白的30％左右。本研究成功构建了高效表达I型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因的工程菌，为获得抗原性强、特异性

4、好的HSV一1蛋白抗原奠定了基础。南京医科大掌硕士掌位论文第二部分：I型单纯疱疹病毒糖蛋白G重组表达蛋白的纯化与初步鉴定将表达量较高的HSVl一gG／GST重组工程菌大量培养后加IPTG诱导表达，离心收菌并超声破碎后进行SDS—PAGE电泳检测，证实表达蛋白是以可溶性形式存在。将超声破菌离心的上清用硫酸铵分级沉淀后分别取上清与沉淀用SDS-PAGE电泳检测，证实表达蛋白在40％与500／o饱和度的硫酸铵溶液中沉淀析出，得到浓缩及部分纯化。将这两种沉淀合并溶解、透析后上DEAE-SepharoseFF阴离子交换柱，用不同浓度的NaCl洗脱液分段洗脱，SDS—PAGE电泳检测。

5、收集含有融合表达蛋白的洗脱峰(200mmol／LNaCl)，透析后再上DEAE—SepharoseFF阴离子交换柱，用不同浓度的NaCl洗脱液进一步分梯度洗脱，收集含有表达蛋白的洗脱峰(150mmol／LNaCl)，可除去大部分杂蛋白，获得的融合表达蛋白纯度约达90％。将纯化获得的HSVl一gG／GST融合表达蛋白作抗原，稀释后包被酶联反应板，ELISA间接法检测已知的抗HSV-1IgG阳性血清、抗HSV—lIgM阳性血清与正常人血清，结果显示此表达蛋白能分别与抗HSV一1IgG阳性血清、抗HSV—lIgM阳性血清反应，而不与正常人血清反应。同时Westernblot分析也

6、证实此蛋白抗原能与阳性血清抗体发生特异性结合。以上结果初步说明该融合表达蛋白制备、纯化较容易，且具有较强的抗原表位，与正常人血清亦未出现非特异性反应。本研究建立了表达蛋白的纯化方法，并纯化获得了具有良好抗原性的gG一1蛋白抗原。第三部分：HSV一1抗体检测试剂的初步研制与应用将纯化后的重组表达蛋白HSVl-gG／GST作为抗原包被酶联反应板，待测血清标本为一抗，辣根过氧化物酶标记的抗人IgG、抗人IgM抗体为二抗，ELISA间接法分别检测46份门诊随机血清、20份抗HSV一1IgM阳性血清与51份正常人阴性血清。结果重组蛋白与72％的门诊随机血清(IgG)及20份抗HSV-

7、1IgM阳性_O-清(IgM)均可发生特异反应，而与51份阴性血清(IgM)则不起反应。以上结奔f冀c耩翻串大掌硕士攀位论文果说鞠该115萎舍表达蛋白有较好爨抗原妊争特异性。本研究建立了以ELISA间接法为基础的HSV一1抗体检测方法，并对检测试裁、反应条亭}送行了优化，初步研割了敏感蛙高、转异挂强的HSV—l抗体检测试剂。第四部分：II型单纯疱疹病毒糖蛋白G的季壳源表位分析及其基因克隧通过生物软件筛选出II型单纯疱疹病毒糖蛋白G中优势抗原决定簇，餍PCR技术扩增含强抗原决定簇较集中的基因片段，将克隆的基因片段插入