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《藤黄微球菌Rpf基因克隆表达及纯化鉴定.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、藤黄微球菌Rpf基因克隆表达及纯化鉴定作者：樊爱琳，师长宏，苏明权，薛莹，柏银兰，马静，刘家云，张建芳，程晓东，郝晓柯【摘要】目的：克隆藤黄微球菌Rpf基因，序列测定正确后进行融合表达纯化.方法：采用聚合酶链反应(PCR)方法，从藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌Rpf基因，用限制性内切酶消化后插入到pUC19克隆载体中，测序正确后再亚克隆到融合表达载体pProEXHT中，转化大肠杆菌DH5a,目的基因经IPTG诱导，由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rpf蛋白，在变性条件下对目的蛋白进行纯化.结果：获得藤黄微球菌R
2、pf基因，得到融合6个组氨酸残基的藤黄微球菌Rpf蛋白，可溶性分析发现融合蛋白主要在包涵体中存在，最后在变性条件下，用Ni2+NTA亲和色谱柱纯化目的融合蛋白，纯化获得的融合蛋白纯度大于90%,WesternBlot证实获得的蛋白为所需要的目的蛋白.结论：构建了藤黄微球菌Rpf基因的重组表达载体，并获得了高纯度的融合表达蛋白，为以后的深入研究奠定了基础.【关键词】微球菌，藤黄；分枝杆菌，结核；克隆，分子；基因表达；纯化0引言结核病（TB）是现今全世界范围内最重要的致病和致死因素之一.结核分枝杆菌的休眠状态和生长缓慢是研究结核病的主要
3、障碍.Mukamolova等［1］发现在MicrococcusLuteus（藤黄色微球菌）中发现了一种能促进细菌复苏生长的因子并命名为复活促进因子（Resuscitationpromotingfactor,Rpf）.Biketov等［2］发现Rpf可促进巨噬细胞内受损的休眠期的结核杆菌进入活化增殖状态，且还是宿主免疫系统识别的靶抗原.通过同源性分析发现结核分枝杆菌基因组可编码5种Rpf样蛋白［3］.我们拟克隆表达藤黄微球菌Rpf蛋白，进一步研究其生物学和免疫学特性，以建立临床结核分枝杆菌的快速分离培养方法，并评价其是否可作为候选结核
4、亚单位疫苗的组分.1材料和方法1.1材料藤黄微球菌标准株为西京医院检验科细菌室保存；TaqDNA聚合酶、dNTPs,T4连接酶、Hindlll,BamllI及DNA电泳胶回收试剂盒、质粒提取纯化试剂盒（Promega公司）；E.coliDH5ci为本室保存，pProEXHT质粒为第四军医大学动物实验中心师长宏博士馈赠；金属鳌合亲和层析介质（NiNTA）（Qiagen公司）.1.2方法1.2.1引物设计登陆GenBank,根据藤黄微球菌Rpf基因序列(AC：Z96935)设计引物.P1：5’CGAGGATCCACCATGGACACCA
5、TGACTCTCTTCAC3’含BamHI酶切位点p2：5’TCAAAGCTTTCAGGCCTGCGGCAGGACGAGCTCCT3Z含Hindlll酶切位点和终止码.扩增片段为697bp,由TaKaRa公司合成.1.2.2藤黄微球菌基因组DNA提取刮取适量藤黄微球菌落，TE(pH8.0)洗涤后重悬，加SDS至终浓度为10g/L,蛋白酶K至终浓度0.1g/L,55〜6(TC水浴过夜，分别用等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)、氯仿：异戊醇(24:1)各抽提1次，上层水相加2.5倍预冷的无水乙醇，1/10体积的3mol/L乙酸钠后
6、置-2(TC冰浴1h沉淀DNA,用无水乙醇、700mL/L乙醇先后洗涤沉淀2次,抽干后溶于适量无菌水中.1.2.3藤黄微球菌Rpf基因的扩增、克隆及测序以藤黄微球菌基因组为模板，以P1和P2为引物，扩增目的基因.PCR反应条件：94°C60s,52°C60s,72°C90s,共30个循环，再于721延伸7min.回收PCR产物，经BamHI和Hindlll消化后，然后用T4连接酶连接入经同样酶消化的pUC19中，转化E.coliDH5a感受态细胞.然后涂布于LB平板(含氨节青霉素100mg/L),随机筛选4个菌落，分别接种于5讥含氨
7、节青霉素的LB培养液中，371振荡培养过夜，提取质粒DNA,用Hindlll和BamHl双酶切，37°C过夜，进行10g/L的琼脂糖凝胶电泳，以DL2000为分子质量参照，观察有无约697bp大小的片段，将阳性克隆命名为pUC19Rpf,然后随机挑取3个克隆进行测序.1.2.4重组质粒表达提取测序正确的重组克隆质粒，经Hindlll和BamHl双酶切后，回收目的基因条带，溶于50nL双蒸水中.取目的片段和同样用Hindlll和BamHl双酶切的pProEXHT质粒以3:1的比例混合，用T4连接酶连接，转化E.coliDH5a感受态细
8、胞.然后涂布于LB平板（含氨节青霉素100mg/L）,371培养过夜.随机挑取2个菌落，分别接种于5mL含氨节青霉素的LB培养液中，37乜振荡培养过夜.各取1.5mL提取质粒DNA,再以Hindlll和BamHI双酶切鉴定，挑选阳性克
