dhbv衣壳蛋白表达纯化、初步应用及其编码基因转录、表达时相的研究

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1、万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：妇弓扬伽，中年6月彦日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许

2、论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：导师签名纠；匆’铺’．力矿，妒年6月扩日．pf中年{旯f口B万方数据本论文的创新性工作一J0，1—20—73～．5_iliIllllUlIlllIIIIIlUlIllIIIjI1．鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白的表达纯化：对DHBVPreC／C基因进行分子特性分析，构建PreC／C基因原核表达载体，并利用大肠杆菌表达宿主菌Rosetta(DE3)对衣壳蛋白进行了表达。利用

3、重组表达衣壳蛋白的组氨酸标签对其进行纯化，制备了兔抗衣壳蛋白多克隆抗体，并建立了基于重组表达衣壳蛋白的间接ELISA方法。2．DHBV前基因组转录时相的分析及衣壳蛋白表达时相的研究：本研究首次采用荧光定量PCR方法，在DHBV感染细胞后的不同时间点，对DHBV复制过程中所转录的长链RNA(preRNA)进行了定量分析。同时运用兔抗DHBV衣壳蛋白多克隆抗体，采用间接免疫荧光及免疫印迹对DHBV衣壳蛋白在相同时间点的表达情况进行检测。结果发现在病毒感染的早期，preRNA不用于衣壳蛋白的翻译。该结论为揭示病毒感染早期其衣壳蛋

4、白在胞内包裹、组装基因组的机制提供了新的线索。万方数据四川农业大学顸lj学位论文中文摘要1．DHBVPreC／C基因序列分析、克隆表达、蛋白纯化及多抗制备为了建立DHBV快捷准确的检测方法及深入探究鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白的功能，对DHBVCHv株PreC／C基因及其编码蛋白的分子特性进行了分析。PCR方法扩增编码衣壳蛋白的PreC／C基因，经测序鉴定后构建PreC／C基因的原核表达载体pET-32a(+)／PreC／C。利用大肠杆菌宿主表达菌Rosetta(DE3)对衣壳蛋白进行诱导表达，同时对诱导温度、诱导时问、IPTG

5、浓度进行了优化。利用重组衣壳蛋白的组氨酸标签，采用Ni离子亲和层析柱对衣壳蛋白进行纯化。通过纯化的衣壳蛋白免疫大白兔制备兔抗DHBV衣壳蛋白多克隆抗体。结果表明，PreC／C基因长789bp，编码262个氨基酸的衣壳蛋白。构建有PreC／C基因原核表达载体pET-32a(+)／PreC／C在表达菌Rosetta(DE3)qb诱导表达时，DHBV衣壳蛋白在诱导温度37℃、IPTG浓度0．8mM、诱导时间6h的条件下其表达量达到最高，占菌体总蛋白量的80％以上。利用Ni离子亲和层析柱对带有组氨酸标签的目的蛋白进行纯化后得到条带

6、单一、浓度达2mg／mL的重组衣壳蛋白。通过纯化的衣壳蛋白免疫动物所得到的血清在琼扩试验中效价达到1：32。2．鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白间接ELISA方法的建立为了建立稳定可靠的DHBV血清学诊断方法，本研究利用重组表达的DHBV衣壳蛋白建立间接ELISA诊断方法。利用棋盘滴定法对抗原最佳包被量进行了优化，随后对抗原的包被时间、包被温度进行了优化，同时对间接ELISA方法中的封闭时间、二抗工作浓度等条件进行了优化。利用建立的ELISA方法对27份DHBV阴性血清进行检测，确定了判定样品为阴性或阳性的临界值，并通过该临界值对建

7、立的ELISA方法敏感性、特异性、重复性及可靠性等进行了评估。结果表明，基于重组表达衣壳蛋白间接ELISA方法的最佳反应条件为：抗原37。C包被2h后4"C过夜，6．799／孔；l％BSA37℃封闭2h；二抗工作浓度为1：1000；待检血清稀释至l：160。根据确定的临界值O．392，DHBV阳性血清能被检测为阳性的最大稀释倍数为1：12800；重复性试验表明组内、组间试验的变异系数均小于10％；该ELISA方法检测常见鸭源病原抗血清时均无阳性结果；对75份临床样品进行检测时，与传统的检测方法PCR相I万方数据四川农业大学

8、硕士学位论文比达到95．45％的符合率。说明该DHBV衣壳蛋白间接ELISA检测方法具有灵敏度高、重复性好、特异性强的特点。此外，本方法运用羊抗鸭IgG抗体替代了兔抗鸭与羊抗兔抗体的联用，是该方法更为简便快捷、节约成本。3．PreC／C基因转录时相及表达时相的研究DHBV基因组在复制的过程中会先转录形成