细胞红蛋白的基因表达、分离纯化与性能研究

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2、进行检索，可以采用影印、缩印或其它手段保存、汇编学位论文。学位论文作者签名：日期导师签名：日期聊城大学硕士学位论文摘要细胞红蛋白(Cytoglobin,Cygb)是近期在脊椎动物组织中发现的第四种珠蛋白，它虽具有典型珠蛋白“three-over-three”类型的-螺旋三明治折叠结构，但其蛋白肽链E-螺旋中的His81却与血红素配位，形成与神经红蛋白(Neuroglobin,Ngb)相似的六配位结构。在Cygb的血红素附近有一个与外部相连的大的疏水性蛋白基质空腔，可能用于提供配体进出的路径。Cygb几乎在人体各类组织中都有表达，可能具有携氧、储氧、氧感受器

3、以及过氧化物酶等功能，此外它也可能与胶原形成有关，但其具体的生物功能仍未完全明确。因此本文对细胞红蛋白进行了基因表达和分离纯化，并研究了其基本的化学生物学性质以及可能的生物功能。主要的工作有：一、细胞红蛋白的基因表达、分离纯化与谱学表征。将带有人细胞红蛋白基因pET3a质粒转化至E.ColiBL21(DE3)plys中进行发酵表达，细胞红蛋白以可溶性和包涵体两种形式同时表达。可溶性蛋白依次经硫酸铵分级沉淀，Hiprep16/10QFF阴离子交换柱，Hiload16/60Superdex75凝胶过滤柱和CMSepharoseFF阳离子交换柱纯化，得到电泳纯的可

4、溶性蛋白(Scygb)；包涵体蛋白经盐酸胍变性溶解、外加血红素重组和柱层析得到了电泳纯的可溶性蛋白(Icygb)。电喷雾质谱测得Scygb的分子量为21403.8Da，Icygb的分子量则为21556.8Da。紫外可见光谱表明，Scygb和Icygb的氧化态都在416nm处有强的吸收峰，500nm～600nm间有宽的弱吸收峰，还原态都在428nm，531nm和561nm有吸收峰，但两者的A428(R)与A416(O)峰值比有所差别。荧光光谱表明，Scygb和Icygb的发射光谱的最大波长都为340nm。但相同浓度时，Scygb的荧光强度要比Icygb的荧光强

5、度高一倍左右。圆二色光谱表明，Scygb和Icygb的-螺旋相对含量分别为64.4%和62.0%。还原态均在424nm和555nm处有正峰，氧化态都在257nm和412nm处有正峰，在285nm处有负峰。但与Icygb相比，Scygb的还原态在425nm处呈现一负峰，氧化态在453nm处呈现一负峰。两者的热稳定性和酸碱稳定性的变化情况也不相同。通过以上对比，得出由可溶性形式纯化出的Cygb应该更接近于天然态，因此主要对这种形式的蛋白进行了深入研究。二、细胞红蛋白的荧光光谱和圆二色光谱研究。利用同步荧光光谱、荧光探针和i聊城大学硕士学位论文荧光猝灭研究了Cy

6、gb的荧光特性以及溶液pH和巯基乙醇(2-ME)对Cygb构象的影响。波长差为20nm和80nm时Cygb在不同浓度下的同步荧光光谱结果表明，蛋白浓度对肽链中色氨酸和酪氨酸的荧光强度的影响不相同。波长差为20nm和80nm时Cygb在不同pH值溶液中的同步荧光光谱结果表明，在酸性环境中色氨酸和酪氨酸荧光峰的强度迅速增大，在碱性环境中两者荧光峰的强度明显降低。ANS荧光探针表明，在酸性环境中蛋白分子的构象发生了改变，出现能够结合ANS的疏水区。利-+用丙烯酰胺和I、Cs离子在有或无2-ME存在下对Cygb内源荧光进行猝灭作用的研究表明，三种猝灭剂对Cygb的荧

7、光猝灭遵循Stern-Volmer方程，但它们的猝灭效率明显不同。当向蛋白溶液中加入2-ME后，三种猝灭剂对Cygb荧光基团的猝灭常数均有所增加。利用圆二色光谱研究了环境因素对Cygb二级结构的影响。结果表明，在蛋白浓度较低时，蛋白含有较高的-螺旋。随着温度的升高，Cygb的-螺旋含量逐渐减小。即使温度达到95℃，它仍保持有20％的-螺旋结构，说明Cygb具有较高的热稳定性。在弱酸性和弱碱性溶液中，Cygb的二级结构都会有不同程度的破坏。在甲醇和乙醇中，Cygb的-螺旋含量明显增加，这说明醇类可以诱导其-螺旋的生成。三、细胞红蛋白的去折叠研究。利用

8、紫外可见光谱、荧光光谱和圆二色光谱研究了酸诱导细胞红