蓝藻蛋白的分离与纯化

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.藻蓝蛋白的分离与纯化.. .藻蓝蛋白的分离与纯化.. .一、实验目的和要求1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白一般的提取和纯化的方法；2、掌握蛋白含量测定方法；掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的实验技术。二、实验原理藻蓝蛋白（PC）是一类普通存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素，也是一种天然色素蛋白，具有水溶性，可用作食品着色剂。此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体细胞的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。另外，它还具有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子ＮＨ可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同研究表明可用25%(NH4)2SO4饱和度沉淀除去杂质，55%(NH4)2SO4沉淀藻蓝蛋白。盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。最常用的脱盐方法是透析。蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，而小分子物质可以自由透过半透膜，顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。蛋白含量的测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、考马斯亮蓝法等）本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的，含量，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nm变为595nm，在一定范围内，蛋白质的含量与595nm处吸光值成正比。离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变PH或离子强度来实现，与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。本实验以蓝藻为材料，采用反复冻融、分步盐析法对藻蓝蛋白进行提取和初步纯化，采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，然后使用DEAE-纤维素柱层析对提取的藻蓝蛋白进一步纯化（由于来源不同和种类的差别，目前研究报道的藻蓝蛋白等电点尚无一致结论，但都在3.4-4.8之间，其中钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的等电点为4.3，在PH6.5磷酸盐缓冲液中带负电，所以选择DEAE-纤维素阴离子交换柱）。预期得到纯度较高的藻蓝蛋白。三、试剂与仪器1、试剂螺旋藻藻粉0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PH6.5）、标准蛋白（0.1mg/L）、考马斯亮蓝G-250、0.5mol/LNaOH、0.5mol/LHCl、NaCl、0.5mol/LHCl、NaCl、硫酸铵、透析袋、DEAE纤维素、奈氏试剂四、实验步骤（一）、藻蓝蛋白的提取及初步纯化1、藻蓝蛋白抽提：采用反复冻融法破碎细胞，磷酸盐缓冲液浸提蛋白。具体操作：取螺旋藻粉1g，加入0.01mol/LPH6.5的磷酸盐缓冲液10mL，充分搅拌混匀。室温浸泡30min-1h后，在-20℃和38℃之间反复冻融数次（3-5次）。细胞破碎后，将悬浮液移入离心管，加入10mL0.01moL/LPH6.5的磷酸盐缓冲液，混匀，静止30min，4000r/min离心20min，上清液即为抽提得到的藻蓝蛋白混合液。2、分步盐析：采用不同浓度的硫酸铵分步盐析初步纯化出藻蓝蛋白。具体操作：取上清液，用25%饱和度的硫酸铵4℃盐析30min，然后4000r/min离心20min，所得上清液用55%饱和度的硫酸铵放入冰箱盐析30min，4000r/min离心20min，弃去上清液，离心收集得到沉淀即为藻蓝蛋白。3、透析去盐得到的沉淀用10mL0.01moL/Mlph6.5的磷酸盐缓冲液溶解，然后将藻蓝蛋白粗提液置于透析袋（截留分子质量为10Kd）中在蒸馏水中透析以去除盐离子。每隔1h换一次透析液，换3-4次。(二)藻蓝蛋白含量测定1、制作标准曲线；2、样品含量测定；3、计算结果。具体操作步骤如下：取洁净干燥的试管若干，按表1-1比例配置标准蛋白溶液。原本标准蛋白的浓度为0.1mg/mL。表1-1标准溶液配置管号标准蛋白（mL）蒸馏水（mL）10120.20.830.40.640.60.450.80.261.00混匀此6组试管中的标准蛋白溶液，分别加入4mL考马斯亮蓝G-250，摇匀(充分混匀)，室温放置5min后在595nm波长处别色，以1号试管调零点，得到5组标准蛋白溶液在595nm处的吸光值A595。以标准蛋白浓度（mg/mL）为横坐标，以A595值为纵坐标作图，得到的趋势线即标准曲线。将提取的藻蓝蛋白溶液1mL适当稀释（6-10倍左右），再取0.2mL，补充水到1mL，同上进行比色操作，得到其595nm处的吸光值，通过标准曲线推算其含量。（三）藻蓝蛋白纯度的测定测定A620和A280值，纯度可用A620/A280来表示。将上述稀释后的样品，用可见分光光度计，测定其在620nm.. .波长处的吸光值A620；再将样品转出，装入石英比色皿，放入紫外分光光度计，测定其在280nm波长处的吸光值A280。由于藻蓝蛋白在620nm波长处有特征吸收峰，其纯度可以用A620/A280来表示。因此，根据在可见和紫外分光光度计中得到的数据就可以推算出提取的藻蓝蛋白样品的纯度。（四）藻蓝蛋白的进一步纯化1、DEAE-纤维素处理、装柱和平衡2、上样、洗脱3、测定纯化的蛋白浓度和纯度，并分别计算回收率和纯化倍数。具体操作：3.测定纯化的蛋白浓度和纯度，并分别计算回收率和纯化倍数。具体操作：用三倍柱床体积的0.01mol／LpH6.5磷酸盐缓冲液平衡。将初步纯化得到的藻蓝蛋白液上DEAE-纤维素柱，采用0.01mol／LpH6.5磷酸缓冲液洗脱（含0.4mol／LNaCI）进行洗脱，柱上层的深蓝色部分大多被迅速洗脱下来，只残留少量蓝色。流速控制在10d／min，用小试管收集洗脱液，每管收集2mL（或30滴），收集10-12管（呈现蓝色的液体内含有目的蛋白）。测定每管样品的A620，横横坐标洗脱体积、纵坐标A620值，绘制洗脱曲线。合并所有管中的样品，A620和A280值，计算纯度。然后用0.01mol／LpH6.5磷酸缓冲液（含0.6mol／LNaCI）洗脱，洗脱下的是藻蓝蛋白。柱料的再生：用0.5ml／LHCl溶液处理柱料，洗2-3倍柱床体积，用水洗至pH6.0,0,01mol／LpH6.5磷酸缓冲液平衡。四、数据处理及实验结果.. .表四根据数据制作藻蓝蛋白的洗脱曲线六、思考题1、蛋白含量测定方法有哪些？各有什么特点？（1）、微量凯氏定氮法，（2）、Folin-酚法，（3）紫外吸收法，、特点：操作简便迅速，且不消耗样品（可以回收），低浓度的盐类不干扰测定。（4）、考马斯亮蓝染色法，2、盐析分离蛋白的原理是什么？盐在水溶液中电离所形成的正负离子ＮＨ可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同研究表明可用25%(NH4)2SO4饱和度沉淀除去杂质，55%(NH4)2SO4沉淀藻蓝蛋白。盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。最常用的脱盐方法是透析。蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，而小分子物质可以自由透过半透膜，顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。3、离子交换层析纯化蛋白的原理？离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变PH或离子强度来实现，与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。4、藻蓝蛋白的功能有哪些？广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。藻蓝蛋白带有荧光,可用作荧光标记物藻蓝蛋白具有刺激红细胞集落生成，类似红细胞生成素(epo)的作用；藻蓝蛋白具有补血、调整白血球和提高淋巴细胞活性的作用；增加体能、促进红血球增长，能增进机体免疫功能，促进生长发育；藻蓝蛋白还具有抑制某些癌细胞的作用；.. .具有很高的营养价值和医疗价值。藻蓝蛋白作为天然食用色素，它可以改善食品的色泽，不仅能提高食品的档次，而且能增加食品中的功能成份。藻蓝蛋白是少见的色素蛋白之一。它不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高。藻蓝蛋白是水溶性色素，清亮鲜艳，外观悦目可爱，可作为食品、化妆品的添加剂。七、注意事项1、标准曲线制作规范、准确，样品含量测定准确；.. .2、藻体细胞要反复冻融3次以上，确保细胞全部破碎；3、注意离心机使用；4、DEAE-纤维素柱层析，洗脱液的离子浓度严格控制。..