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时间:2019-01-26
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1、.藻蓝蛋白的分离与纯化...藻蓝蛋白的分离与纯化...一、实验目的和要求1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能,藻蓝蛋白一般的提取和纯化的方法;2、掌握蛋白含量测定方法;掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的实验技术。二、实验原理藻蓝蛋白(PC)是一类普通存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素,也是一种天然色素蛋白,具有水溶性,可用作食品着色剂。此外,它具有强烈的荧光,在分子生物学上被制成荧光探针,是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值,不但能提高机体细胞的非特异性免疫功能,而且对特异性免疫功能有促进作用。另外,它还具有清除自由基的能力,可以抗疲劳
2、,延缓衰老,对人体的生理功能有重要的生物学意义。利用盐析沉淀蛋白质的基本原理:盐在水溶液中电离所形成的正负离子NH可吸引水分子,从而夺取蛋白质分子上的水化膜,还可中和部分电荷,致使蛋白质聚集,从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同,当使用某种中性盐对其进行盐析时,所需的最低盐浓度各不相同研究表明可用25%(NH4)2SO4饱和度沉淀除去杂质,55%(NH4)2SO4沉淀藻蓝蛋白。盐析出来的蛋白质,需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。最常用的脱盐方法是透析。蛋白质是大分子物质,它不能透过半透膜,而小分子物质可以自
3、由透过半透膜,顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。蛋白含量的测定有紫外分光光度计法和显色法(Folin-酚法、考马斯亮蓝法等)本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的,含量,考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色,当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色,最大光吸收由465nm变为595nm,在一定范围内,蛋白质的含量与595nm处吸光值成正比。离子交换层析法纯化蛋白质,常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM-纤维素),阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)。蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团
4、结合,结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力。因此,被吸附的蛋白质的洗脱通过改变PH或离子强度来实现,与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。本实验以蓝藻为材料,采用反复冻融、分步盐析法对藻蓝蛋白进行提取和初步纯化,采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量,然后使用DEAE-纤维素柱层析对提取的藻蓝蛋白进一步纯化(由于来源不同和种类的差别,目前研究报道的藻蓝蛋白等电点尚无一致结论,但都在3.4-4.8之间,其中钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的等电点为4.3,在PH6.5磷酸盐缓冲液中带负电,所以选择DEAE-纤维素阴离子交换柱)。预期得到纯度较
5、高的藻蓝蛋白。三、试剂与仪器1、试剂螺旋藻藻粉0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH6.5)、标准蛋白(0.1mg/L)、考马斯亮蓝G-250、0.5mol/LNaOH、0.5mol/LHCl、NaCl、0.5mol/LHCl、NaCl、硫酸铵、透析袋、DEAE纤维素、奈氏试剂四、实验步骤(一)、藻蓝蛋白的提取及初步纯化1、藻蓝蛋白抽提:采用反复冻融法破碎细胞,磷酸盐缓冲液浸提蛋白。具体操作:取螺旋藻粉1g,加入0.01mol/LPH6.5的磷酸盐缓冲液10mL,充分搅拌混匀。室温浸泡30min-1h后,在-20℃和38℃之间反复冻融数次(3-5次)。细
6、胞破碎后,将悬浮液移入离心管,加入10mL0.01moL/LPH6.5的磷酸盐缓冲液,混匀,静止30min,4000r/min离心20min,上清液即为抽提得到的藻蓝蛋白混合液。2、分步盐析:采用不同浓度的硫酸铵分步盐析初步纯化出藻蓝蛋白。具体操作:取上清液,用25%饱和度的硫酸铵4℃盐析30min,然后4000r/min离心20min,所得上清液用55%饱和度的硫酸铵放入冰箱盐析30min,4000r/min离心20min,弃去上清液,离心收集得到沉淀即为藻蓝蛋白。3、透析去盐得到的沉淀用10mL0.01moL/Mlph6.5的磷酸盐缓冲液溶解,然后
7、将藻蓝蛋白粗提液置于透析袋(截留分子质量为10Kd)中在蒸馏水中透析以去除盐离子。每隔1h换一次透析液,换3-4次。(二)藻蓝蛋白含量测定1、制作标准曲线;2、样品含量测定;3、计算结果。具体操作步骤如下:取洁净干燥的试管若干,按表1-1比例配置标准蛋白溶液。原本标准蛋白的浓度为0.1mg/mL。表1-1标准溶液配置管号标准蛋白(mL)蒸馏水(mL)10120.20.830.40.640.60.450.80.261.00混匀此6组试管中的标准蛋白溶液,分别加入4mL考马斯亮蓝G-250,摇匀(充分混匀),室温放置5min后在595nm波长处别色,以1号
8、试管调零点,得到5组标准蛋白溶液在595nm处的吸光值A595。以标准蛋白浓度(mg/mL)为
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