蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定

《蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、实验一、蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定 第一部分蛋白质的表达、分离、纯化 1、目的要求（1）了解克隆基因表达的方法和意义。（2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。2、实验原理克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠

2、杆菌BL21中，在37℃，IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。3、试剂和器材一、试剂[1]LB液体培养基：Trytone10g,yeastextract5g,NaCl10g,用蒸馏水配至1000mL.[2]氨苄青霉素：100mg/mL[3]上样缓冲液：100mMNaH2

3、PO4,10mMTris,8MUrea,10mM2-ME,pH8.0[4]WashingBuffer：100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,pH6.3[5]ElutionBuffer:100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,500mMImidazole,pH8.0[6]IPTG二、器材摇床，离心机，层析柱（1′10cm）4、操作方法一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1.接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mLLB液体培养基中（含100ug/mL氨苄青霉素），

4、37℃震荡培养过夜。2.转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600=0.6-0.8。取10ul样品用于SDS-PAGE分析。3.加入IPTG至终浓度0.5mmol/l,37℃继续培养1-3h.4.12，000rpm离心10min,弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化1.NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mLNTA介质，并分别用8mL去离子水，8mL上样缓冲液洗涤。2.重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融

5、菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液,用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60min,4℃12000rpm离心30min,将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10ul上清样品用于SDS-PAGE分析。3.上清样品以10-15mL/h流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10ul样品用于SDS-PAGE分析。4.洗脱杂蛋白：用WashingBuffer以10-15mL/h流速洗柱，直至OD280=0.01.分步收集洗脱液，约3-4h,取10ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE分析。5.洗脱目标蛋

6、白：用ElutionBuffer洗柱，收集每1mL级分，分别取10ul样品用于SDS-PAGE分析。第二部分蛋白质的鉴定1、目的要求（1）了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理。（2）掌握凝胶电泳实验操作规程。2、实验原理电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。但如果加入某种试剂使电荷因素消除，则电泳迁移率就取决于分子

7、的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。十二烷基硫酸钠（SDS）就具有这种作用。在蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原，蛋白质—SDS复合物带上相同密度的负电荷，并可引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因此聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行，其电泳漕缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液。该凝胶包括积层胶和分离胶两部分。当两电极间接通电流后，凝胶中形成

8、移动界面，并带动加入凝胶的样品中的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。由于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率，使蛋白依各自的大小得到分离。3、试剂和器材一、试剂[1]30％Acr－Bis贮存液：30gAcr