蛋白质的分离纯化与分析鉴定

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1、蛋白质的分离纯化与分析鉴定摘要：蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点。根据蛋白质的酸碱性质、分子大小与形状、溶解性质及其与配体亲和性等,对其分离纯化和分析鉴定方法进行了综述。分离纯化某一特定蛋白质的一般方法包括前处理、粗分级分离、细分级分离和纯度鉴定四步，本文重点介绍讨论了步骤三中的几种主要方法。关键词：蛋白质，分离，纯化，鉴定一、引言生物体内的大部分生命活动如催化代谢反应、物质运转、运动的相互协调、兴奋的传导、生长与发育等，均是在蛋白质的参与下完成的。因此,研究蛋白质对了解生命规律、指导工业生产、医药实践有着重大意义,而蛋白质的分离纯化是蛋白质研究中必不可少的一个环节。必须要了

2、解目的蛋白的分子量、等电点、溶解性及稳定性等基本性质才能制定出合理的分离纯化方法。由于不同的蛋白质结构和性质不同,分离方法也不同,例如根据分子大小可使用差速离心、分子筛、超滤或透析等分离技术；根据溶解度大小的不同，使用盐析、溶剂抽提、分配层析、结晶等方法分离；根据所带电荷的不同，可采用电泳、等电点沉淀、离子交换层析等方法；根据结合亲和性，可用新和层析进行分离。蛋白质的分离纯化技术种类是很多的而且发展很快某些技术如以前不多见的超滤分离方法,目前在国内应用已相当普遍，除此之外广泛使用的层析、电泳方面也不断出现新的技术和方法。如层析方面,高压液相色谱是一种具有快速和分辨力的柱层析技术。二、正文

3、分离纯化某一特定蛋白质的一般方法包括前处理、粗分级分离、细分级分离和纯度鉴定四步：一、选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的材料进行预处理。根据分离纯化的原料不同,要采取不同的方法进行预处理。例如动物材料要去掉结缔和脂肪组织；植物和细菌要将细胞壁进行破碎；植物种子的去壳除脂；微生物的菌休和发酵液要进行分离等等。破碎主要采取超声波振荡、研磨、高压挤压或酶处理等方法。组织和细胞破碎以后,选择适当的缓冲溶液将目的蛋白质提取出来,细胞碎片等不溶物质用离心或者过滤的方法除去。二、分离纯化某一蛋白质首先要将蛋白质从原来的组织中释放出来,并且保持原有的天然状态,不丢失活性物质。常用的溶剂是稀盐酸

4、溶液和缓冲液、某些与脂类结合牢固、或分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取。三、用适当的方法将蛋自质从抽提液中分离出来并将所需蛋白质和其他杂蛋白分开。由于原料中蛋自质成分复杂往往含有几百种以上，因此提纯一种蛋白质通常需要多步骤完成。四、纯度鉴定的简便方法是层析法和电泳法、检验有生物活性的蛋白质则用测定活性法。一般要用两种以上的方法相互验证,才能肯定一种蛋白质的纯度。本文将重点讨论步骤三中的几种主要方法。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜

5、上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。经常与盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小，可选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤以克服这一缺点得到更理想的效果。层析法：最常用的层析法是凝胶过滤和离子交换柱层析。凝胶过滤又叫分子筛层析，凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，比“网眼”大的蛋白质分子不能进人凝胶颗粒内部,沿着颗粒间隙流动,流程短,流速快,最先流出柱外；比“网眼

6、”小的分子则进人凝胶粒内部,沿着孔道移动,从一个颗粒流出,又进人另一颗粒,所以下移速度慢,随后被洗脱下来。这样溶液中的物质就按不同分子量筛分开了，可用于蛋白质的脱盐、分离、提纯、分析等等。离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。利用此反应将要分离的混合物先在一定pH值的溶液中全部解离；而后流过固相使之与固相的离子进行交换，吸附于固相；再根据混合物中各组分解离度的差别，用不同pH值溶液分别洗

7、脱下来。等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低；相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。王洪新等研究茶叶蛋白质提取过程发现,pH值为4时茶叶蛋白提取效果最好,提取率达到36.18%,初步纯化得率为91.10%。亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而