蛋白质的分离与纯化 重组蛋白质表达分离与纯化技术讲座

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1、重组蛋白质表达分离与纯化技术讲座赢润生物蛋白质(Proteins)蛋白质是一切生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成。http://www.yrbio.com氨基酸人类一共有20种常见的氨基酸，它们的排列组合形成了人类绝大多数的蛋白质。http://www.yrbio.com氨基酸链组成的蛋白质蛋白质是由氨基酸分子呈线性排列所形成，相邻氨基酸残基的羧基和氨基通过肽键连接在一起。http://www.yrbio.com我们为什么要纯蛋白质生命科学研究：蛋白质的结构功能，以及其在生理以及病理

2、学的意义；工业或者治疗：比如血液制品人血白蛋白，以及从猪胰脏中获得的胰岛素制剂；用于药学研究等，比如能够使一些细菌产生的抗性的蛋白；http://www.yrbio.com生物体如何合成蛋白质我们知道蛋白质虽然结构变化多端，但其实由20种氨基酸以特定的序列组成。但这个序列又从何来？近代分子生物学发现，绝大多数蛋白质序列都是脱氧核糖酸DNA编码的，但无论是人类，高等动物，高等植物还是细菌。即称为中心法则(GeneticCentralDogma)AAADNAUUURNAPheProtein苯丙氨酸http://www.yrbio.com生物体的中心法则中心法则(Genetic

3、CentralDogma)：是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质的转录和翻译的过程，以及遗传信息从DNA传递给DNA的复制过程。DNA复制DNA转录RNA翻译http://www.yrbio.comCentralDogmaofMolecularBiologyProposedbyFrancisCrick,1958http://www.yrbio.com细胞内的蛋白质合成http://www.yrbio.com如何获得蛋白质？天然蛋白从动植物组织中得到天然状态的蛋白有机化学合成重组蛋白利用基因工程方法在宿主中表达的外源性蛋白。利用有机化学的方法合成，多数只

4、能合成55个氨基酸以下的肽链http://www.yrbio.com重组蛋白表达中心法则告诉我们：既然蛋白质的全部氨基酸信息都包含在DNA序列中，所以我们可以利用DNA来合成蛋白。我们可以利用宿主的中心法则系统，合成包括一些宿主本来根本不存在的蛋白，即重组蛋白。DNA复制DNA转录RNA翻译http://www.yrbio.com重组蛋白表达大致过程包括基因获取以及构建，宿主的转化或者转染，以及最后的蛋白质收集。基因获取基因克隆宿主转化蛋白获得原料准备蛋白合成http://www.yrbio.com启动重组蛋白表达1.原料-需要有正确而且完整的编码蛋白质的DNA的序列；2

5、.工厂-需要有将DNA转录翻译的宿主系统，并处于正常工作中，将DNA序列正确加工成蛋白质产品；http://www.yrbio.com常用的重组蛋白表达体系原核体系（工程杆菌-改造大肠杆菌）；昆虫体系（天蚕蛾sf9,high5细胞）；哺乳动物体系：（仓鼠卵细胞CHO，人囊胚肾细胞Hek293等）；CHO细胞-赢润细胞库工程杆菌-赢润基因库http://www.yrbio.com为何选原核表达为什么选大肠杆菌做原核系统的蛋白质表达？容易克隆与基因改造；生长迅速，表达快速；培养容易而且非常廉价；大肠杆菌菌落-固像培养大肠杆菌菌液-液像培养http://www.yrbio.co

6、m适应大肠杆菌中心法则保证DNA不被降解能够随着细菌的增殖而同时被扩增（可复制）；保证质粒在在细菌生长时不能丢失（不丢失，不出错）；能够正确被大肠杆菌宿主翻译体系识别得到翻译正确蛋白质（可转录）。http://www.yrbio.com载体载体能够承载靶蛋白的DNA序列，并使该基因的转录和翻译完全能配合宿主系统，即被大肠杆菌识别。同时保证靶蛋白的基因序列可扩增，可复制，可表达。http://www.yrbio.com原核表达载体一般构架复制启动子Ori，保证质粒在细菌中复制（可复制）抗生素抗性基因，生长抗性压力下的细菌必须拥有质粒（不丢失)转录起始，核糖体结合位点http

7、://www.yrbio.comFigure1:DiagramofthepGEXexpressionvector.pGEX-系列载体同样拥有启动子Ori（可复制）抗性基因（不丢失）及转录lac基因（可转录）。http://www.yrbio.com常见的原核表达载体pGEX系列，包括pGEX-KG,pGEX-4T-2等pET系列，包括pET-15b，pET-22a，pET-42a等；pDESTpMAL系列；pBAD系列：http://www.yrbio.com常见的原核载体pTYB1，pMAL,pET28-b，pET-20b(