dhbv衣壳蛋白靶向核酸酶抗病毒初步研究

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1、？？＾－＊＊＊＼一？？！＇．／一＿、’、：．＇分类号Ｓ８５８．，－学号Ｓ２０１２３５１６．３２：—？Ａ四川农业大学＇／Ｖ屋．？、ｔ著Ｉ硕ｄｂ学位论文ＮＤＨＢＶ衣壳蛋白铅向核酸酪抗病毒初步研究—ｒ＇？，．．■Ｖ．张彬凡，．．／．．．？＇Ｖ爭＇；．指导教师贾仁勇教授．．－一＼占乐．甲，学科专业预防兽医学＼？＇４—＾‘－ｆ‘研巧方向贪病学，，，＞Ｉ．节立’一？、：＊．Ａ：．．．．２０１５年５

2、月＼ｆ■／＇＇窒？；．？、／：八、Ｊ，‘？－．，、、、？１：．．气Ｖ论文独创隹声明的学位论文是我个人在导师指导下进行研巧工作所取得的本人郑重声明：所呈交，成果，学位论文中不包含其他个。尽我所知除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料一同工作的同志对本研究所做的任何贡献。与我均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。＇研巧生签名：訓年ｒ月曰：ＩＴ群ｉ杉关于论文使用授权的声明，目Ｐ本人完全了解四川农业大学有关保留：学校

3、有权保留、使用学位论文的规定并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ采用影印。同意四川农业大学可ｙ、用不、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：部ｉｉ杉於／ｆ年ｆ月ｊｆ日ｊ导师签名年＾月以巧四川农业大学硕±学位论文中文摘要根据本实验室提交的鸭己型肝炎病毒（ＤｕｃｋｈｅａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓＤＨＢＶ）ＣＨ４株（登ｐ，录号ＥＵ４２９３２４）基因的序列信息Ｗ及ＧｅｎＢａｎｋ上金黄色葡萄球茜核酸酶（登录号ＣＰ００６６３０．１）的序列信息，设计Ｄ

4、ＨＢＹ衣壳蛋白（Ｃａｐ）基因和金黄色葡萄球菌核酸酶（ＳＮａｓｅ）基因的特异性引物。ＷＤＨＢＶ病料和金黄色葡萄球菌为模板，对ＤＨＢＶＣＨ４株Ｃａｐ基因和金黄色葡萄球苗ＳＮａｓｅ基因进行ＰＣＲ扩増。开展了下研究：１．金黄色巧苗巧苗按度酶基因的原核表法及巧巧分析利用ＰＣＲ方法对金黄色葡萄球茵核酸酶ＳＮａｓｅ基因进行扩增，将ＳＮａｓｅ基因连接至ＧＭ－Ｔ载体并进行酶切鉴定及测序ｐ，回收目的基因并亚克隆至原核表达载体－Ｔ－３２ａ＋ＥＴ＋－ＳＮａｓ，ｐＥ，构建重组表达质粒３２ａ（）ｅ转入大麻杆菌表达菌化）旅化７，ＩＰＴＧ（）ｐ。诱导表达，收集表达的核酸酶蛋白，同时

5、利用ＴＤＡ变色法检测该酶的生物学活性一一，；ＳＮａｓｅ大小为４６８ｂ，致步构结果表明成功扩增了基因ｐ与预期片段大小；进ＥＴ－３２ａ＋－ＳＮａｓｅ建了重姐原核表达质粒ｐ，转化至表达菌化ｗａｔｆ，通过ＩＰＴＧ的诱导（）－－表达，重组原核表达质粒ｐＥＴ３２ａ＋ＳＮａｓｅ成功表达分子量大小约为３５ＫＤａ核酸酶（）蛋白；同时检测出表达的重组核酸酶蛋白具有核酸酶活性，为后续实验选择核酸酶作为抗病毒因子奠定了基础。２．巧乙型斤炎病毒衣壳蛋白与金黄色巧菊巧茵核巧巧煤合蛋白在大肪巧苗中的表Ｌ达、巧性分析及其撤ｌｉ清的制备根据实验室提交ＧｅｎＢａｎｋ的ＤＨＢＹＣＨ４株（登录

6、号抓４２９３２４）完整Ｃａｐ基因序列和ＧｅｎＢａｎｋ上金黄色葡萄球菌核酸酶（登录号ＣＰ００６６３化０的序列，结合重叠延伸ＰＣＲ原理分别设计引物。Ｗ实验室保存ＤＨＢＶ阳性血清提取ＤＮＡ作为模板，扩増Ｃａｐ基因，同时提取金黄色葡萄球茜基因组扩增ＳＮａｓｅ基因，利用融合ＰＣ民技术扩増Ｃａ－ＳＮａｓｅ融合基因ＧＭ－Ｔ载体上经酶切和测序鉴定后ｐ；连接到ｐ，，目的基－因亚克隆至原核表达载体ＥＴ－３２ａ＋Ｔ－３２ａ＋－ＳＮａｓｅｐ（），构建重组原核表达质粒ｐＥ（）Ｃａｐ，转入表达菌化ｗｅｔｏ；为了提高融合蛋白表达量，对诱导条件（温度、ＩＰＴＧ浓度、时）－间进斤优化，经ＩＰＴ

7、Ｇ诱导表达，获的顧合表达蛋白表达重组顯合ＣａＳＮａｓｅ蛋；ｐ－白经ＮｉＮＴＡ柱亲和层析纯化，用兔抗鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白多克隆抗体检测纯化一的重组顯合蛋白，并进步将纯化的蛋白免疫昆明鼠，制备多克隆抗体；同时ＴＤＡ变色法检测纯化的融合蛋白是否具有核酸酶蛋白的生物学活性。结果表明，成功扩増Ｉ四川农业大学硕±学位论文一ａ－ｓｅ，大３６ｂ，致融合基因ＣｐＳＮａ小为１２ｐ与预期片段大小；构建了重组表达质粒－ＥＴ