诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用

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1、诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用【摘要】目的：建立能稳定分泌抗诺如病毒(Norovirus)N蛋白的单克隆抗体(niAb)细胞株，制备抗诺如病毒核衣壳蛋白的mAb,为诺如病毒的早期快速检测及致病机制的研究提供实验材料。方法：用E.coli表达的GII组广州株NVgzOl(DQ369797)NorovirusN蛋白免疫BALB/c小鼠,通过PEG使小鼠脾细胞和Sp2/0细胞融合，使用HAT选择性培养基培养融合细胞，用间接EIJSA和Westernblot测定mAh的效价、免疫球蛋白亚型和Mb的特异性，并将各mAbZ间进行配对。结果：通过细胞融合和克隆化，共筛选出4株分

2、泌抗NorovirusN蛋口抗体的杂交瘤细胞株N2C3、N7C2、N4B1、N8A9O间接ELISA和Westernblot检测结果表明，这4株mAb都可以与E.coli表达的GII组广州株NorovirusN蛋白产生特异性反应，并且能与天然粪便标木中的GII组Norovirus产生特异性反应。配对结果显示N2C3和N7C2Z间配对，对表达蛋白和天然病毒都具有较强的检测灵敏度。结论：获得了诺如病毒GII组特异性mAb,为制备免疫诊断试剂盒及致病机制的研究奠定了基础。【关键词】NorovirusNVgzOl核衣売蛋白单克隆抗体诺如病毒作为流行性肠胃炎的主耍病因之一，无论在发展中国家还是发

3、达国家，从儿竜到成年人都可以受到诺如病毒感染，并可造成爆发流行，成为影响人类健康的不可忽视的问题，近年來逐渐引起了研究者的重视。美国CDC经过评估认为，每年在美国发生的食源性疾病有2300万宗是由诺瓦克及诺瓦克样病毒引起的［1］；在欧洲，数据显示1995〜2000年间，有超过85%的食源性病毒肠胃炎爆发案例由诺瓦克及诺瓦克样病毒引起［2］。由于人类诺如病毒分为GI和GII两组［3,4］,根据北京［5］、太原［6］和武汉［7］三地的血清学调查结果，初步认为GII组病毒为我国主要流行组。山于诺如病毒无法在体外感染细胞及动物模型來进行培养分离鉴定，目前对诺如病毒的诊断方法主要是免疫电镜法(I

4、EM)、放射免疫法(RIA)、ELISA法、RealTimePCR法等［8］,其中，夹心ELISA方法，即使用单克隆抗体(mAb)捕获患者粪便标本中的病毒抗原来进行检测的方法，由于交叉反应性小，特界性较强且敏感度较高，成为目前研制诺如病毒检测试剂所主要采用的方法。本研究中我们以E.coli表达的GII组广州株NorovirusN蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠并制备mAb,为研制诺如病毒检测试剂盒奠定基础。1材料和方法1.1材料诺如病毒粪便标本为使用DakoCytomation公司的IDEIANorovirus抗原检测试剂盒检测为阳性的标本。6周龄的雌性BALB/c小鼠，购自中山大

5、学实验动物中心。Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系为本实验室保存。诺如病毒核衣壳蛋白表达重组质粒pET28a(+)NoroNP由本实验室制备及保存，诺如病毒N蛋白基因的克隆、表达和鉴泄方法见文献报道［9］。PEGMW3350购自Sigma公司，HAT、HT和RPMT1640购自Gibco公司，新生牛血清购自杭州四季青公司，羊抗鼠IgG购自BOSTER公司。其他试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1免疫小鼠用pET28a（+）NoroNP重组表达载体表达诺如病毒GII组广州株的全长衣壳蛋白，收集产物经Ni2+亲和层析柱纯化，以此纯化后蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，每次免疫剂量为70Pg/

6、只，免疫途径为腹腔免疫，每间隔2周免疫1次，累计免疫3次，初次免疫使用弗氏完全佐剂，后两次免疫使用弗氏不完全佐剂；笫3次免疫完成10d后小鼠尾部取血检测免疫效果，血清效价达到104后可脾内注射进行加强免疫，3d后取脾融合。1.2.2细胞融合取免疫后小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按常规融合方法融合。1.2.3阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化融合后细胞用含HAT的RPMI1640培养液进行筛选，10d后待杂交瘤细胞生长至视野的1/3大小时，取100uL细胞上清用ELISA方法对抗体进行检测。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行多次克隆化，待所冇单克隆细胞培养液屮抗体阳性率为100%时，将生长状态良好

7、并抗体ELTSA值高的单克隆细胞扩人培养。1.2.4腹水的制备及效价测定将6丿制龄以上的BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL/只弗氏不完全佐剂，诱导1周后腹腔注射1X106个杂交瘤细胞，7〜10d后可产生腹水。收集腹水离心除去细胞碎片。用重组蛋白（5n）g/L）作为抗原包板，腹水从10-2起10倍稀释至10-7作为一抗（连续梯度稀释），羊抗鼠IgG作为二抗，用间接ELISA方法对腹水效价进行测定。1.2.5mAb免疫球蛋白亚类鉴定采用PIERCE