诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、 鉴定和初

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1、诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、鉴定和初【摘要】目的:建立能稳定分泌抗诺如病毒（Norovirus）N蛋白的单克隆抗体（mAb）细胞株,制备抗诺如病毒核衣壳蛋白的mAb,为诺如病毒的早期快速检测及致病机制的研究提供实验材料。方法:用E.coli表达的GⅡ组广州株NVgz01（DQ369797）NorovirusN蛋白免疫BALB/c小鼠,通过PEG使小鼠脾细胞和Sp2/0细胞融合,使用HAT选择性培养基培养融合细胞,用间接ELISA和）、放射免疫法（RIA）、ELISA法、RealTimePCR法等［8］,其中,夹心ELISA方法,即

2、使用单克隆抗体(mAb)捕获患者粪便标本中的病毒抗原来进行检测的方法,由于交叉反应性小,特异性较强且敏感度较高,成为目前研制诺如病毒检测试剂所主要采用的方法。本研究中我们以E.coli表达的GⅡ组广州株NorovirusN蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠并制备mAb,为研制诺如病毒检测试剂盒奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料诺如病毒粪便标本为使用DakoCytomation公司的IDEIANorovirus抗原检测试剂盒检测为阳性的标本。6周龄的雌性BALB/c小鼠,购自中山大学实验动物中心。Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系为本实验室保存

3、。诺如病毒核衣壳蛋白表达重组质粒pET28a（＋）NoroNP由本实验室制备及保存,诺如病毒N蛋白基因的克隆、表达和鉴定方法见文献报道［9］。PEGMI1640购自Gibco公司,新生牛血清购自杭州四季青公司,羊抗鼠IgG购自BOSTER公司。其他试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1免疫小鼠用pET28a（＋）NoroNP重组表达载体表达诺如病毒GⅡ组广州株的全长衣壳蛋白,收集产物经Ni2＋亲和层析柱纯化,以此纯化后蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,每次免疫剂量为70μg/只,免疫途径为腹腔免疫,每间隔2周免疫1次,累计

4、免疫3次,初次免疫使用弗氏完全佐剂,后两次免疫使用弗氏不完全佐剂;第3次免疫完成10d后小鼠尾部取血检测免疫效果,血清效价达到104后可脾内注射进行加强免疫,3d后取脾融合。　　1.2.2细胞融合取免疫后小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按常规融合方法融合。　　1.2.3阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化融合后细胞用含HAT的RPMI1640培养液进行筛选,10d后待杂交瘤细胞生长至视野的1/3大小时,取100μL细胞上清用ELISA方法对抗体进行检测。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行多次克隆化,待所有单克隆细胞培养液中抗体阳性率为100%时,将生长状态良

5、好并抗体ELISA值高的单克隆细胞扩大培养。　　1.2.4腹水的制备及效价测定将6周龄以上的BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL/只弗氏不完全佐剂,诱导1周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞,7～10d后可产生腹水。收集腹水离心除去细胞碎片。用重组蛋白(5mg/L)作为抗原包板,腹水从10-2起10倍稀释至10-7作为一抗（连续梯度稀释）,羊抗鼠IgG作为二抗,用间接ELISA方法对腹水效价进行测定。　　1.2.5mAb免疫球蛋白亚类鉴定采用PIERCE公司的MonoclonalAntibodyIsotypingKit(HRP/ABTS)对mAb的

6、亚类进行鉴定,按试剂盒说明书进行。　　1.2.6mAb特异性检测用Ab对GⅡ组广州株诺如病毒衣壳蛋白,及对天然GⅡ组诺如病毒粪便标本的特异性反应情况。　　1.2.7mAb配对试验和初步应用将效价较强的N2C3、N7C2、N4B13株mAb用硫酸铵辛酸法纯化［10］,并分别将这3株抗体用辣根过氧化物酶（HRP）标记。将纯化过的抗体分别用5mg/L浓度包被酶标板作为一抗,诺如病毒衣壳蛋白作为抗原,标上HRP酶的3株抗体分别作为二抗,使用ELISA夹心法对mAb进行配对试验。配对完成后挑选灵敏度相对较高而本底相对较低的配对方式,与PCR方法（本实验

7、室建立）检验为诺如病毒GⅡ组阳性的水样腹泻患者粪便标本进行反应。　　2结果　　2.1分泌抗诺如病毒衣壳蛋白mAb的杂交瘤细胞株的建立用pET28a（＋）NoroNP重组表达载体表达诺如病毒GⅡ组广州株的全长衣壳蛋白免疫小鼠,取小鼠血清测效价,在满意滴度下将小鼠进行脾内加强免疫,3d后取脾细胞与Sp2/0细胞进行融合。10d后用纯化的NVNP5mg/L包被酶标板,杂交瘤细胞上清作为一抗,羊抗鼠IgG作为二抗检测抗体,并同时用pET28a（＋）载体表达的轮状病毒蛋白作为阴性对照,以排除与大肠杆菌BL21细胞成分和pET28a（＋）载体成份反应的

8、假阳性抗体。对抗体分泌能力强的培养孔用有限稀释法进行2次克隆化,共筛选出4株能稳定分泌抗诺如病毒核衣壳蛋白抗体的细胞株,分别为N2C3、N7C2、N4