猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备

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1、两南大学硕十学何论文ABSTRACT猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备预防兽医学专业硕士研究生邵烈刚指导教师蔡家利教授(摘要)猪繁殖与呼吸综合征是一种能引起母猪繁殖障碍、新生仔猪呼吸道症状及高死亡率的传染病。该病于1987年首先暴发于美国，随后迅速向世界各地蔓延；我国郭宝清等-j：1996年从疑似本病的猪群中分离至-IJPRRSV，从而确认了PRRS在我国的存在。由于基因的变异，近两年我国大部分地区暴发了以高传染性、高死亡率为特征的高致病性蓝耳病，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。目前P

2、RRS的确诊依赖于病毒的分离鉴定、血清学诊断方法以及分子生物学诊断方法等。血清学诊断方法包括免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接荧光抗体试验(IFA)、乳胶凝集试验(LAT)、血清中和试验(SN)以及酶联免疫吸附实验(ELISA)等：分子生物学诊断方法包括聚合酶链式反应(PCR)技术、核酸探针原位杂交技术(ISH)等。这些诊断方法由于检测时间较长及检测所需仪器设备较昂贵，多数不适合于临床快速诊断。近几年来兴起的免疫胶体金诊断试纸法很好的弥补了这些不足，但要想成功的开发出胶体金诊断试纸，首先必须制备高

3、亲和力、高特异性的单克隆抗体。本实验的目的就是制备高亲和力、高特异性的抗PRRSVN蛋白的单克隆抗体，为下一步开发PRRS胶体金诊断试纸建立基础。本试验利用南京农业大学己构建的含有PRRSVN蛋白基冈的重组表达载体阳性菌，在37℃条件下，用终浓度lmH的IPTG诱导表达4h。经SDS—PAGE分析，表明N基因在大肠杆菌中得到了高效表达。经镍柱亲和层析纯化，获得了纯度较高、免疫学活性较好的N蛋白。以此蛋向作为抗原对BalB／C,']',鼠进行长程免疫，取抗体效价较高的小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞用PE

4、G一1500进行融合，融合率为60．6％。建立间接ELISA方法，用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体，初检阳性率为16．1％。经多次亚克隆及反复筛选，获得了2株能稳定分泌抗PRRSV单抗的杂交瘤细胞株，命名为4D3禾115F6。将得到的单抗株进行初步鉴定，两单抗株特异性针对PRRSV共同的抗原表位。4D3雨i5F6杂交瘤细胞株经过反复冻存、复苏及多次传代，均能分泌较高效价的抗体，其抗体效价保持在1：1000以上：将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内诱生腹水，7天后将收集的腹水以辛酸一硫酸铵法提纯，间接ELISA

5、检测其效价达1：102400以上。因此，上述杂交瘤细胞将会在PRRS的诊断中发挥重要的作用。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒核农壳蛋白单克隆抗体两南人学硕十学何论文ABSTRACT曼鼍!!!!曼!曼!曼曼鼍曼曼曼!!!!曼!!曼皇曼皇曼皇舅I一_Io皇曼曼曼曼曼!曼曼皇曼曼!皇!!!曼量ABSTRACTPorcinereproductiveandrespiratorysyndromeisahighlyinfectiousviraldiseaseofswine，itcausesrespiratoryprob

6、lemsandhighmortalityinneonatalpigletsandreproductivefailureinenceinteSOWS．PRRSwasfirstreportedin1987inUnitedStateswhereitbecamewidespread，sincethenthediseasehasspreadwidelythroughoutmostpartoftheworld．Thecausativeagent，porcinereproductiveandrespiratorysy

7、ndromevirus(PRRSV)，wasfirstisolatedfrompiggroupsseemtobeinfectedbythisdiseasebyGuoBaoqingwhocamefromchina，whichconfirmeditsexistenceinourcountry．Recentyears，HighPathogenicPRRSbreakoutinmostpartofourcountrycharacterisedhighinfectivityandhi【ghmortality。whi

8、chhasbeenthemajorcauseofeconomiclossesintheswineindustry．ThediagnosisofPRRSisdependontheisolationandcharacterizationofthePRRSV,serologyanalysis，moleculardiagnosisandSOon．SerologyanalysisincludeIPMA，IFA，L讧SN，andELISA．molecu