猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp1a的原核表达及多克隆抗体和单克隆抗体的制备

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1、ｗ古单位论义，亏Ｉ麵３猪巧殖与呼吸综合征病毒ｎｓｐｌａ的原核表达及多克隆抗体和单克隆抗体的制备司朝朝巧廣Ｉ乂聲二〇—五年六月分类号说５８．２８密级公开ＵＤＣ硕±学位论文猪巧殖与呼吸综合征病毒ｎｓｐｌａ的原核表法及多克隆抗体巧单克隆抗体的制备司朝朝学科专业临巧兽睽学指导教师李恭馈副教授论文答辩日巧２０１５年５月巧号学位授予日期答辩委员会主席胡庭俊教授本研究得到的项目巧助：国家自然基金青年科学基金（Ｎｏ．３１３０２０

2、７３）国家自然科学基金重大项目（Ｎｏ．３１４９０６００）国家重点基础研究发展计划９７３计划）（ＮＯ．２０１４ＣＢ５４２７００）（国家自然科学基金面上项目３１４７２１７７）（广西大学学位论文原倒性和使用授枚声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大一学或其它单位的学位而使用过的材料。与我同工作的同事对本论文的研究王作所做的贡

3、献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被査阅和借阅，可将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行。检索和传播，可从采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文本学位论文属于：□保密，在年解密后适用授权。囚不保密。＂＂（请在上相应方框内打Ｖ）２０巧６９：论文作者签名；司辦朝日期年月

4、号指导獅签名日期：２０１５年６月９号作者联系电话：电子邮箱：猪繁殖与呼吸综合征病毒ｎｓｐｌａ的原核表达及多克隆抗体和单克隆抗体的制备摘要猪繁殖与呼吸综合征（Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｉｒａｔｏｒｓｎｄｒｏｍｅ，ｐｐｙｙＰＲＲＳ）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ一ｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ＰＲＲＳＶ）弓樞的种传染病，该病的主要特征是母猪出现繁殖障碍及仔猪出现严重的呼

5、吸道症状。自１９８７年在美国首次发现Ｗ来，在全球主要养猪国家广泛流行１９９６。年郭宝清等从猪场流产胎儿分离出该病毒，证实了我国存在ＰＲＲＳ的流行。在此后的时间里，该病在国内大部分地区流行并在部分地区呈上升趋势，给我国养猪业造成了极大的经济损失。ＰＲＲＳＶ是一种有囊膜的单股正链ＲＮＡ病毒。研究表明，该病毒感染机体后能够引起免疫抑制，形成持续性感染，具有抗体依赖性增强作用，并且病毒基因组遗传变异显著。病毒基因组编码的蛋白可划分为结构蛋白和非结构蛋白。非结构蛋白的功能主要作用在病

6、毒ＲＮＡ复制合成阶段并能够调控宿主对病毒的免疫反应过程。非结构蛋白ｌａ（ｎｓｐｌａ）含有锋指结构－域、木瓜蛋白酶样半化氨酸蛋白酶活性区域、Ｃ末端延伸区等区域，能够－抑制Ｉ干扰素产生，在ＰＲＲＳＶ逃逸机体免疫的过程中起到重要的作用。本研究扩增出ｎｓｐｌａ基因片段，构建原核重组质粒，表达重组蛋白作为免疫原，免疫动物后获得多克隆抗体及单克隆抗体。实验内容主要包括：１、ＰＲＲＳＶｎｓｐｌａ原核表达及多克隆抗体的制备－ｌｓＷ真核重组质粒ｃＤＮＡ３．１ｎｓｐａ为模板，扩增出ｎｌａ片段

7、，构建原核ｐｐＥＴ３２ａ－ｎ表达质粒ｐｓｐｌａ，转化到大厥杆菌ＢＬ２ＵＤＥ３饼优化培养条件。在‘Ｃ３７条件下，ＩｍＭ诱导剂异丙基硫代半乳糖巧（ＩＰＴＧ）诱导表达４ｈ，菌液超声破碎后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳表明重组蛋白包涵体形式大量表达；大量诱Ｉ导菌液并超声破碎一，高速离也后得到包涵体，经过系列缓冲液洗涂后用８Ｍ尿素缓冲液溶解包涵体，复性的包涵体作为免疫原免疫新西兰大巧兔。免疫兰次后，Ｗ包涵体复性液作为包被抗原，问接ＥＬＩＳＡ检测兔多克隆抗１；体血清，血清效价达到２０４８０００

8、１＾上。２、ＰＲＲＳＶｎｓｐｌａ原核表达及单克隆抗体的制备ｃＤＮＡ３１－ｌｌＷ真核重组质粒ｐ．ｎｓｐａ为模板，扩增出ｎｓｐａ片段，构建原核°２８ａ－ｎｓａＢＬ２表达质粒ｐＥＴｐｌ，转化大肠杆菌１（ＤＥ３），在３７Ｃ条件下，ＩｍＭ（ＩＰＴＧ）化ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳表诱导剂异丙基硫代半乳糖巧诱导表达，明重组蛋白Ｗ包涵体形式大量表达，用８Ｍ尿素缓冲液溶解包涵体后，采用透析复性；复性的重組蛋白包被ＥＬＩ