猪繁殖与呼吸综合征病毒orf7和orf5双基因的原核表达研究

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1、第19卷5期中国病毒学19（5）：476-4802004年10月VIROLOGICASINICAOctober2004*猪繁殖与呼吸综合征病毒orf7和orf5双基因的原核表达研究**乐敏，邱德新，陈焕春，蒋增海（华中农业大学动物医学院动物病毒室，湖北武汉430070）ExpressionoftheCombinedorf7andorf5GenesofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusinE.coli.**YUEMin，QIUDe-xin，CHENHuan-chun，JIANGZeng-hai(Labo

2、fAnimalVirology，CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070,China)Abstract：AccordingtothenucleotidesequenceofPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV),twopairsofprimersweredesignedandusedtoamplifiedtheorf7andorf5genesbyRT-PCR,respectively.Byus

3、ingtheEcoRI、SpeIandHindⅢsites,bothgeneswereclonedintopMD-18Tvectorinturn,thensequencingandcomparingthehomologiesofthecloninggenes.Thecombinedorf7andorf5geneswassubclonedintoaprokaryoticexpressingvectorpGEX-KG,therecombinantplasmidnamedpGEX-KGNEwasconstructedandtransformedintoE.coli

4、BL21.TheresultsofSDS-PAGEandWestern-blotindicatedthatthecombinedgenesoforf7andorf5andGlutathion-S-transferase(GST)wasexpressedinE.coliBL21asafusionproteinGST-NEabout64kDainmolecularweight,andthisfusionproteinshowedreactiveactivityimmunologically.Thisstudylaysafoundationforthedevelo

5、pmentoftheserodiagnosticmethodsandvaccinesforPRRSV.Keywords：Ｐorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus；orf7；orf5；ExpressionoftwogenesinE.coli.摘要：根据PRRSV已知序列设计两对引物，采用RT-PCR方法分别扩增orf7和orf5基因片段。利用EcoRI、SpeI和HindⅢ位点将orf7和orf5基因片段依次克隆到pMD-18T载体，构建成重组质粒pMD18NE，并比较所克隆基因序列的同源性。将串联的orf7

6、和orf5基因亚克隆到原核表达载体pGEX-KG，构建重组原核融合表达质粒pGEX-KGNE，并转化BL21，SDS-PAGE和Western-blot分析表明：orf7和orf5基因与GST获得了融合表达，并且表达的融合蛋白GST-NE具有免疫学反应活性，这为猪繁殖与呼吸综合征血清学诊断方法的建立及疫苗研究打下基础。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；orf7；orf5；双基因原核表达中图分类号：S852.65文献识别码：A文章编号：1003-5125(2004)05-0476-05[1,2]猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合后暴发该病。亚洲地区中国台湾1

7、991年出现此征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome病，日本1994年暴发PRRS，中国大陆1996年报[3~5]virus,PRRSV)引发的一种新的病毒性传染病，以母道此病开始流行并分离到病毒。随着国际贸易猪发热、厌食、早产、流产、死胎、弱仔等繁殖障日益密切，PRRS已成为世界性疾病，几乎存在于[1]碍及仔猪呼吸系统疾病和高死亡率为特征。该病世界上每一个养猪国家，给世界养猪业造成了巨大最早于1987年报道于美国南部，不久便在全美迅的经济损失。速蔓延。随后加拿大、德国、荷兰等一些国家也先PRRSV属尼多病

8、毒目（Nidovirales）动脉炎病收稿日期：20