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《修饰的orf5基因增强猪繁殖与呼吸综合征dna疫苗的体液免疫》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、中国兽医学报2005年1月第25卷第1期ChinJVetSciJan.2005Vol.25No.11修饰的ORF5基因增强猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的体液免疫*江云波,方六荣,肖少波,牛传双,张辉,陈焕春(华中农业大学动物医学院,湖北武汉430070)摘要:为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因DNA疫苗的免疫效力,将通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)插入ORF5的中和表位和覆盖表位间,获得修饰后的ORF5基因ORF5M。在此基础上,进一步构建了ORF5M的真核表达质粒pCI-52M。间接免疫荧光证实体外表达后,免疫BALB/c小鼠,检测免疫
2、后的ELISA抗体和中和抗体,并与未经修饰的ORF5基因真核表达质粒pCI-52进行比较。结果表明,修饰后的DNA疫苗pCI-52M诱导的ELISA抗体和中和抗体均明显优于未经修饰的DNA疫苗pCI-52,是一种具有良好开发前景的PRRS新型疫苗。关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;ORF5基因;PADRE表位;DNA疫苗中图分类号:S852.65;Q78文献标识码:A文章编号:1005-4545(2005)01-0001-03猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒质粒pKG-53和真核表达质粒pCI-52均由本室方六荣博士(porcinereproductivea
3、ndrespiratorysyndromevirus,构建并保存[9]。Marc-145细胞由德国巴伐利亚州动物保健中PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的新传染病[1]。免疫接心Czerny博士赠送,Hela细胞购自中国典型培养物中心。种是预防和控制该病的主要措施,但现有的商品化疫苗(弱毒BALB/c小鼠购自湖北省预防医学科学院实验动物中心。苗和灭活苗)均存在一定程度的缺陷。其中弱毒苗虽然免疫效1.2工具酶与试剂各种限制性内切酶、T4DNA连接酶均TM果较好,但存在散毒和返强的危险性,并且返强的几率相当为TaKaRa产品。脂质体转染试剂盒LipofectaMINE2
4、000高[2];灭活苗与弱毒苗相比,虽然安全性较好,但产生的保护为Invitrogen公司产品。DNA快速回收试剂盒购自上海生工力不强,需要反复多次的免疫接种,而且效果不稳定,还经常生物工程公司。HRP标记的羊抗鼠IgG、FITC标记的羊抗兔[3]IgG均为SBA公司产品。导致免疫失败。可以说,缺少安全、有效的疫苗是目前预防和控制PRRS发生与流行甚至大暴发的主要障碍,迫切需要1.3ORF5基因的修饰与表达质粒构建采用PCR扩增和安全、有效、廉价的新型疫苗。拼接方法,将编码PADRE表位的核苷酸序列引入ORF5基由ORF5基因编码的糖基化囊膜蛋白GP5,是PRRSV因
5、的中和表位与覆盖表位之间,其中引物P51和P5m1可扩的主要结构蛋白,参与体液免疫与细胞免疫,因此是发展新型增ORF5基因N端96bp,并同时引入长39bp的PADRE表疫苗的良好目标基因。Pirzaden等[4]用编码GP5的真核表达位,两端依次设计XhoⅠ和PstⅠ酶切位点。P5m2和P52,可质粒免疫猪,可使接种猪产生抗GP5的特异性抗体,接种猪扩增ORF5基因后一部分的507bp,两端依次设计PstⅠ和可免于强毒攻击造成的全身性病毒血症和肺部病变,并使间XbaⅠ酶切位点。上述引物均由上海生工生物公程公司合成。质性肺炎和支气管肺泡炎明显减轻。Kwang等[5]用
6、编码4种引物序列如下:结构蛋白(GP4、GP5、M、N)的基因构建了4种DNA疫苗免P51:5′-GAACTCGAGAGTATGTTGGGGAAATGCTTGACC-3′疫猪,以由GP5构建的表达质粒激发的抗体具有最强的中和病毒的能力。但上述研究均发现,表达GP5蛋白的DNA疫苗P5m1:5′-TTTCTGCAGAGCGGCAGCCTTCAGGGTCCAG诱导的中和抗体不高(<1∶8)。最近,Ostrouski等[6]在采用GCAGCCACGAACTTGGCGTTGGCGTTGACGAGC-3′P5m2:5′-TTTCTGCAGAGCAACAGCAGCCTCTC-3′
7、噬菌体表面展示技术确定GP5中和表位时,发现与中和表位紧邻的上游存在一个非中和表位,此表位具有类似于HIV中P52:5′-TTTTCTAGAGACGACCCCATTGTTCCGC-3′覆盖表位的覆盖效应[7],也正是这一覆盖表位的覆盖效应,导ORF5基因2部分序列的扩增条件均为:95.0℃5min变性后进入循环,95.0℃1min,55.0℃1min,72.0℃1min,致GP5中和表位无法充分暴露,从而难以激发很强的中和抗35个循环后72.0℃延伸10min。PCR产物ORF5m1与体。基于这一发现,本试验对ORF5基因进行了修饰,即将通用型辅助性
