含hsp70的猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5与n蛋白基因的核酸疫苗构建与免疫研究

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1、四川农业大学硕士学位论文中文摘要本试验根据Genbank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)lORF5基因、ORF7基因和结核分枝杆菌Hsp70基因设计合成特异性引物，以本实验室保存的PRRSV-SCQ株提取其总RNA为模板，RT-PCR扩增出369bp的目的片段ORF7A(含终止子)和ORF7B，并克隆到pMDl9一T载体中；以本实验室构建的pMDl8-T-ORF5和pMDl8．T-Hsp70为模板，PCR扩增出516bp和1878bp的目的片段ORF5和Hsp70，其分别克隆到pMDl9．T上；扩增PRRSV-SCQ株ORF7A和ORF7B基因分别插入pMD

2、l9．T-ORF5中，得到T-ORF5一ORF7A和T-ORF5．ORF7B。将两者克隆到pCI-neo上，获得pCI．ORF5．ORF7A和pCI—ORF5一ORF7B：再将Hsp70插入pCI—ORF5-ORF7B，构建出重组质粒pCI．ORF5．ORF7B—Hsp70。将pCI—ORF5一ORF7B．Hsp70DNA疫苗免疫健康小白鼠，同时设立pCI-ORF5-ORF7ADNA、pCI-neoDNA、PRRS弱毒疫苗、生理盐水4个对照组，断尾采血并检测ORF5、ORF7和Hsp70的mRNA转录、蛋白表达、细胞因子IFN．Y和IL-4水平以及T淋巴细胞亚群变化。

3、结果显示如下：l、通过质粒的重复测序表明，本研究成功构建了重组质粒pCI．ORF5．ORF7A和pCI-ORF5一ORF7B—Hsp70。2、真核重组表达质粒pCI—ORF5．ORF7A和pC!．ORF5．ORF7B。Hsp70分别接种小鼠14d后，在小鼠外周血(经DNase处理)中均能检测到ORF5和ORF7基因的mRNA：在接种过pCI．ORF5．ORF7B．Hsp70的小鼠外周血(经DNase处理)中可扩增出Hsp70基因的mRNA，表明重组DNA在小鼠体内得到了有效转录。一3、重组质粒pCI．ORF5．ORF7B．Hsp70免疫小鼠后，14d、21d、28d、

4、35d、42d时，用ELISA试剂盒检测血清中PRRSV特异性抗体水平，该组抗体水平高于pCI．ORF5．ORF7A组和PRRS弱毒疫苗组，其28d抗体水平(OD630值为0．875)达到峰值，42d抗体水习Z(OD630值为o．782)有所回落；极显著大于pCI—ORF5一ORF7A组，显著(p

5、A组；显著(pO．05)；CD4+／

6、CD8+比值最高，但与对照组相比差异不显著(p>0．05)。本研究所构建的以Hsp70为分子佐剂的PRRSV-ORF5．ORF7核酸疫苗能够诱导小鼠产生较好的免疫应答，为PRRS新型核酸疫苗的进一步研究提供了参考数据。关键词：PRRSV；分子佐剂；重组质粒；核酸疫苗ll四川I农业大学硕士学位论文Constructionand‘mmuni。。’therecombinantDNAonstructionanllimmunityottllerecomantDAvaccinecontainingGP5，NproteinandHsp70genesforporcinereprodu

7、ctiveandrespiratorysyndromeZengHui妲reventiveVeterinaryMedicine)DirectedbyProf．YanQigui(CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanA鲥culturalUniversity,Ya’all，Sichuan，P．R．China,625014)AbstractInthisstudyaccordingtoGenbankporcinereproductiveandrespiratorysyndromevims(PRRSV)ORF5gene，ORF7g