猪繁殖与呼吸综合征病毒orf5a蛋白结构与功能的研究

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分类号墨墨§2学号—201020—7013南京羞黄戈萼博士学位论文猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究指导教师专业名称研究方向答辩日期孙利厂一割 DISSECTIONOFSTRUCTUREANDFUNCTIONOFORF5APROTEINFORPoRCINEREPRoDUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUSSunLichangSupervisor：．Prof．FanHongjieAThesislUllllllUlllllllUIY2528478SubmittedtoNanjingAgriculturalUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementforTheDoctorDegreeofAgronomyinVeterinaryMedicineCompletedinMay,2013CommencementinJune，2013 原创性l声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名：苫缸-＼1-pl埠5月{；日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。(请在以上方框内打“√”)学位论文作者(需亲笔)签名：幺冬舞-I7．如15年占,El易Et刷¨需亲笔)擞：彩动多乞7彬年舢目 目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯III第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11PRRSV的分子生物学概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1病原学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2病毒的形态及理化特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11．3病毒的基因组及其编码的蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．4病毒基因组编码的结构蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．5病毒侵入细胞及病毒粒子包装出芽机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．52PRRSVoRF5a蛋白研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72．1生物信息学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．72．2ORF5a蛋白和GP5可能由同一个亚基因组mRNA编码⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72．3．ORF5a蛋白在EAV中的功能研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．4．检测病毒粒子中的ORFSa蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．92．5ORF5a蛋白在感染细胞中的表达及定位特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．6ORF5a蛋白的免疫学研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．7ORF5a蛋白的序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．8ORF5a蛋白对PAM细胞蛋白表达的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．112．9结语⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。211材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯221．1质粒、细胞和抗体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯221．2主要试剂盒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯231．3主要生化试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯231．4主要实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯231．5溶液及培养基的配置⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯241．6引物合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯251．7连接产物或质粒的转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯261．8PCR产物回收⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究1．9质粒的抽提⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯271．10平末端DNA片段连接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯281．11T．A克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯281．12突变体克隆的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．291．13全长eDNA克隆的酶切图谱鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯311．14突变体质粒转染细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．311．15间接免疫荧光检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．311．16病毒传代及细胞上清盲传⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．321．17病毒上清RNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯321．18细胞总RNA的提取(Trizol提取细胞总RNA)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．331．19RT-PCR检测病毒基因组及亚基因组⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯331．20空斑形态分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．361．21空斑纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．361．22病毒细胞半数感染量(TCID50)、狈t]定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．361．23多步生长曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．372结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯372．1ORF4／ORF5区间插入突变体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯372．2ORF4／ORF5区间插入突变体的拯救⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯382．3ORF4／5区间插入突变病毒的体外生长特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯402．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白对病毒感染性影响解析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯491材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯501．1质粒、抗体和细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯501．2引物合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．511．3突变体全长eDNA克隆的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯521．4转染和突变病毒的拯救⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯541．5RT-PCR和核酸测序检测病毒基因组⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．541．6间接免疫荧光分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯541．7生长动力学和空斑形态学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯542结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯552．10RF5a缺失突变病毒的拯救⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．552．20RF5a缺失突变病毒的顺式互补实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．57 目录2．3ORF5a延伸突变体外生长特性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯593讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯69l材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．701．1质粒、抗体和细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯701．2引物合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯711．3突变体全长cDNA克隆的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯721．4转染和突变病毒的拯救⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯741．5RT-PCR和核酸测序检测病毒基因组⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。741．6间接免疫荧光分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯741．7生长动力学和空斑形态学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯741．8蛋白杂交实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．741．8．1主要试剂的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．741．8．2SDS．PAGE蛋白电泳⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．751．8．3蛋白杂交实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯761．9双分子互补荧光实验(BiFC)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯762结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯772．1ORF5a蛋白序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯772．2全长eDNA克隆构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯772．3病毒拯救结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯782．4ORF5a蛋白半胱氨酸突变病毒的生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯792．5ORF5a蛋白体外分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8l2．6ORF5a蛋白体外分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯823讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯83参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯86第五章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用的研究⋯⋯⋯⋯⋯911材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯921．1质粒、抗体和细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯921．2引物合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯93I．3RT-PCR和核酸测序检测病毒基因组⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．941．4间接免疫荧光分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯94 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究1．5生长动力学和空斑形态学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯941．6免疫共沉淀实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯951．7双分子互补荧光实验(BiFC)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯962结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯962．1ORF5a蛋白定位分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯962．2ORF5a蛋白与其它囊膜蛋白研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯972．3ORF5a蛋白与2b、GP4蛋白相互作用验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯983讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．100参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．102全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．107j$(谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．109硕博期间论文发表情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．111 摘要猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)给世界养猪业带来巨大经济损失，而目前涉及到PRRSV复制过程的分子机制仍不甚明了。其中，ORF5a蛋白是PRRSV最近鉴定出的结构蛋白。我们在实验室已经拥有的PRRSV全长感染性克隆的基础上，证实ORF5a基因为两型PRRSV复制所必须。接下来，对ORF5a蛋白的结构与功能及与其它结构蛋白相互作用关系等进行了解析，促进了对动脉炎病毒,K．PRRSV复制过程的进一步了解。本研究具体内容如下：1、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究为解决当前PRRSV弱毒疫苗无法区分野毒感染和疫苗接种的问题。实验以JXMl00为骨架构建的全长感染性克隆为基础，在不影响亚基因5结构的情况下在ORF4／ORF5区间插入3“个碱基，构建ORF4／ORF5区间基因插入突变克隆pAJXMin3、pAJXMin4、pAJXMin5、pAJXMin6。通过转染BHK-21细胞进行病毒拯救，发现插入3或6个碱基病毒可以拯救而4或5个碱基不能被拯救。对插入突变致死的突变体分析发现可以检测到亚基因组5、6、7的转录及GP5、N蛋白的表达，说明突变没有影响病毒亚基因组转录和下游基因表达。通过对ORF4／ORF5区间序列分析发现其中存在潜在ORF5a，推测ORF5a蛋白为PRRSV复制过程所必须。本研究在2型PRRSVORF4／ORF5区间中，成功插入基因标识，为创制新型基因工程标记疫苗奠定了基础。2、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5a蛋白对病毒感染性影响解析最新研究表明与PRRSV同属的马动脉炎病毒(EAV)ORF5a蛋白对病毒的感染性非常重要但非必需。而我们在对ORF5密码子优化及ORF4／ORF5基因区间插入研究过程中发现破环ORF5a将造成病毒拯救失败。因此，推测ORF5a蛋白在PRRSV复制过程中是必须的。为了进一步验证假设，利用1型(pSHE)和2型(pAJXM和pAPRRS)PRRSV全长感染性克隆，在不影响其它基因编码蛋白及亚基因组二级结构的情况下敲除ORF5a基因，构建全长感染性克隆pSHEk5a、pAJXMk5a、pAPRRSk5a。转染BHK．21细胞，结果突变病毒拯救失败，但是突变体病毒结构蛋白表达没有受到影响。接下来，通过在ORF5a敲除突变体过程中共同转染ORF5a真核表达载体的顺式互补实验证实，ORF5a敲除突变体可以利用顺式表达的ORF5a蛋白，包装出单轮 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究感染性病毒粒子。说明突变病毒致死的原因是没有ORF5a蛋白的表达，证实ORF5a蛋白为病毒感染性必须。最后，在pAJXM全长感染性克隆中研究了不同长度ORF5a对PRRSV病毒复制的影响，结果发现46个氨基酸的ORF5a生长速度明显快于延伸后的类型，暗示ORF5a在病毒复制过程中起重要作用。3、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究通过对比目前在临床中分离的PRRSV基因组序列中ORF5a序列，发现在2型PRRSV中ORF5a蛋白29扣30位存在保守半胱氨酸。为研究ORF5a蛋白保守半胱氨酸在病毒复制过程中的作用。我们将感染性克隆pAJXM中半胱氨酸突全部或部分突变为丝氨酸(serine)，构建全长感染性克隆pAJXMSl、pAJXMS2、pAJXMSS。将突变体克隆转染BHK-21细胞均拯救出了突变病毒。说明ORF5a蛋白的保守半胱氨酸对病毒复制是非必需的，但pAJXMS2和pAJXMSS第30位突变为丝氨酸突变体病毒生长特性受到严重影响。接着，将pAJXM中半胱氨酸突全部或部分突变为甘氨酸(glycine)，构建全长感染性克隆pAJXMGl、pAJXMG2、pAJXMGG。pAJXMG2和pAJXMGG第30位突变为甘氨酸时无法拯救出病毒。随后，采用双分子互补荧光实验分析发现，ORF5a蛋白第30位突变为甘氨酸时影响OI心5a蛋白同源二聚体形成。体外实验分析ORF5a蛋白发现ORF5a蛋白同源二聚体通过非共价键形式形成。上述研究结果说明ORF5a蛋白的保守半胱氨酸对病毒复制是非必需，而ORF5a蛋白非共价键同源二聚体对PRRSV复制过程是必须的；ORF5a蛋白的第30位半胱氨酸为该蛋白的关键位点。4、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用的研究目前对于ORF5a蛋白与PRRSV其它结构蛋白相互作用关系仍不清楚。为了研究ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用关系，首先分析PRRSV感染MARC．145细胞过程中，ORF5a蛋白在MARC．145细胞中的定位，发现ORF5a蛋白主要定位于细胞的核周隙及细胞膜上，与病毒的其它结构蛋白有着类似的定位。接着，利用双分子互补荧光实验分析ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用发现，ORF5a蛋白可与GP4和2b蛋白有相互作用。采用免疫共沉淀实验证实了这个结果。综上所述，在本章中研究发现ORF5a蛋白与病毒的其它结构蛋白有着类似的定位且与病毒的GP4和2b蛋白有相互作用。这些结果为进一步了解ORF5a在病毒在复制过程的作用奠定基础。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；ORF5a蛋白；感染性；半胱氨酸突变；蛋白互作II ABSTRACTDissectionofstructureandfunctionof0RF5aproteinforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusPRRSVinfectionleadstomasseconomiclosstotheswineindustryworldwide．However，thedetailmolecularmechanismofhowthevirusreplicateincell，isstillpoorunderstand．Inthisstudy，basedoninfectiousfull-lengtheDNAclonesofPRRSV，wefoundthatORF5aproteinWasdemonstratedtobeessentialforvirusinfectivityinbothtype1andtype2PRRSV．Tthetranscriptionregulationproperties，structureandfunctionsofORF5aproteinaredissected．ThiswilllayfoundationtobetterunderstandofartedvirusandtodevelopefficientwaystopreventPRRSVinfection．1．StudyontheinsertionsequenceofPRRSVORF4／ORF5regionTodevelopmentofnovelgenemarkervaccinesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)，Westudiedafull-lengthinfectiousclonepAJXM，whichderivedfromJXMl00．InthisstudyaseriesofmutagensisPCRofaninfectiouscloneofpAJXMwereconducted，differentnucleotideshavebeeninsertedintothedifferentpositionofthespacerof10bpbetweenORF4andORF5．OurresultshowedthatthespacerCansuffer3or6bpinsertedbetweenthespacer．Growthkineticsandviralplaqueassayinvitroshowedthatthevirologicalcharacteristicsofthemutantvirusweresamiliarwiththewidetypeandthemutantsreplicatedwellasitsparentalstrain．However,thespacerCansuffer4or5bpinsertedbetweenthespacer．Thisstudyopensnewpathwaysforthefurtherdevelopmentofnovelgenemarkervaccines．2．Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)ORF5aproteinisrequiredforvirusinfectivityTheORF5aprotein，anewlyidentifiedviralproteininvirusparticleofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PrOSy)，isahydrophobicproteinwith46or51aminoacids(aa)．Thehomologous5aproteinofEquineArteritisVirus(EAV)，anothermemberofthefamilyArteriviridae，isimportantforvirusinfection，butnotessential．Initially,wefoundthatORF4／ORF5callinsert3or6nt，howevercan’tinsert4or5nt．WeIII 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究hypothesizedthatORF5aproteinisrequiredforvirusinfectivity．Furthermore，inactivationofORF5aexpressioninbothtype1andtype2PRRSVbyreversegeneticscouldn’tyieldviablePRRSV,andvirusproductioncouldbecomplementedbyCO-transfectionofORF5aproteinexpressionplasmid．However,ORF5aproteincouldbeextendedto91aminoacidsbyinactivationofthestopcodoncandidatesbyreversegenetics．Takentogether,inthisstudy,ORF5aproteinwasdemonstratedtobeessentialforvirusinfectivityinbothtype1andtype2PRRSV,anditsCterminalcouldbevariable．3．Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSⅥORF5aproteincysteinesarenon—essentialPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)openreadingframe(ORF)5containsasmallinternalORF5acapableofencodingaproteinof46or51aa,termedORF5aprotein．ThefunctionofORF5aproteiniScurrentlyunknown．111eORF5aproteinpossessestwocysteinesatpositions29and30thatarehighlyconservedamongNorthAmericanisolates．ThesignificanceoftheORF5aproteincysteineresiduesonvirusreplicationwasdeterminedusinganinfectiousclone．EachcysteineWassubstitutedbyserineorglycineandthemutationswereintroducedintoafull-lengthcloneofPRRSV．WhentransfectedintoMARC．145cells，allserinemutantclonesinducedPRRSV-specificcytopathiceffectsandproducedinfectiousprogenyvirus．ThedataindicatethatcysteineresiduesintheORF5aproteinarenotessentialforreplicationofNorthAmericangenotypePRRSV．珊lileCys30mutanttoglycineaffectedORF5aproteinshomodimerizationwhichisessentialforvirusviability．4．TheMinorEnvelopeproteins2bandGP4ofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusInteractwithoRF5aproteinPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(pggsv)containsthemajorglycoprotein，GP5，aswellasthreeotherminor,namely,GP2a，GP3，andGP4，onthevirionenvelope，andfourothernon．glycoproteins2b，M，N，andORF5aprotein，allofwhicharerequiredforgenerationofinfectiousvirions．Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)openreadingframe(ORF)5containsasmallinternalORF5acapableofencodingaproteinof46or51aa，termedORF5aprotein．Thefunctionof0I讧5aproteiniscurrentlyunknown．TostudytheirinteractionswithORF5aprotein，wehaveclonedeachof吐1eviralstructureproteinsandexaminedtheirexpressionandinteractionwitheachotherintransfectedcellsby(BiFC)andCO—immunoprecipitation(CO-IP)assayusingmonospecificantibodies．Thebimolecularfluorescencecomplementation(BiFC)wasusedtostudyIV ABSTRACTORF5aproteininteractionswithotherenvelopeproteins．OurresultsshowthatORF5aproteininteractedwithGP4and2bprotein，andtheseresultswereconfirmedintransfectedcellsbyCo-immunoprecipitation(Co·IP)assay．KEYWORDS：Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus；ORF5aprotein；viability；cysteinemutation；proteininteractionV 英文缩略表VII 第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白研究进展猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)是一种高度接触性猪传染病病毒。该病毒主要引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，临床表现及危害主要表现在，引起母猪晚期流产或早产，以及小猪呼吸障碍与死亡等。猪繁殖和呼吸综合征最早发生于上世纪80年代末的美国和90年代初的欧洲【l，2】。1996年，首次在我国境内分离到该病原，之后该病迅速成为危害我国养猪业的最重要的病原之一，该病给养猪业带来了巨大的经济损失。2006年，我国江西、江苏、安徽等多个南方省份爆发了猪无名高热病，经研究表明，引起该病的主要病原为发生遗传变异的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒13,41。1PRRSV的分子生物学概述1．1病原学猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)属于套式病毒目(Nidovirales)，动脉炎病毒科(Arteriviridae)。同科的病毒还有马动脉炎病毒(Equinearteritisvirus，EAV)、鼠乳酸脱氢酶增高症病毒(Lactatedehydrogenaseelevatingvirus，LDV)、猴出血热病毒(Simianhemorrhagicfevervirus，SHFV)[51。根据代表株的分离地点和基因差异，PRRSV被分为两个基因型，1型(欧洲型)和2型(北美型)，且两型间的序列相似性不到60％。两个基因型的代表毒株分别为：1991年，Lelystadvirus(LV)分离于荷兰Ⅲ；1992年，VR-2332株，分离于美卧61。1．2病毒的形态及理化特性成熟的PRRSV为圆形或者椭圆形，核心空层直径约40nm，外包裹结构蛋白，总直径约50--60nm。N蛋白通过共价或非共价连接组成的二聚体结构中间包裹病毒RNA组成病毒核心，而非之前推测的20面体结构‘6-91。PRRSV在氯化铯和甘油酒石酸盐梯度中的浮密度为1．19g／ml，蔗糖梯度中为1．14-1．159／ml。PRRSV对温度、pH和去垢剂敏感。PRRSV可在．70。C～．20"C下存活至少4个月， 猪繁殖与呼吸综合征病毒0EF'5a蛋白结构与功能的研究之后随着温度的升高病毒活力会下降[61。病毒稳定存在于pH6．5．7．5的环境中，PH<6．5或者>7．5时其感染性减弱【10】。去垢剂等有机试剂会破坏病毒的脂质囊膜，使病毒失去感染性。PRRSV对脂溶剂氯仿和乙醚敏感【6，ll】，消毒剂存在情况下对PRRSV感染性有显著影响【酬。尽管PRRSV在环境中相对比较脆弱，但它可以通过气溶胶在空气中传播4．7km[12J。PRRSV无血凝活性，不能凝集马、鸡、鹅、牛、猪、羊和人的红细胞。曾经在日本分离到两株抗原性与VR．2332有关的PRRSV，对小鼠红细胞表现出凝集性，用去污剂预处理这些病毒使其凝集活性增强，表明其可能释放了一种与凝集性有关的囊膜蛋白t131。1．3病毒的基因组及其编码的蛋白PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长15．1kb，不分节段，5’端有帽子结构，3’端有polyA尾，5’端编码病毒非结构蛋白，占全长4／5，3’端编码病毒结构蛋白(图1．1)。PRRSV有11个开放阅读框(ORF)，分别为ORFla、nsp2TF、OI江1b、0RF2、0I江2a、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5、OI江6、ORF7，分别编码pplab、nsp2TF、ppla、GP2、E、GP3、GP4、ORF5a、GP5、M、N蛋白慨14以引。ORFl编码pplab和ppla多聚蛋白，是病毒的复制酶复合体，可进一步划分为ORFla和ORFlb，二者有16个核苷酸的重叠，ORFlb的翻译采用了．1核糖体移码(．1ribosomalframeshifting)机制【14】，其中重叠区的滑动序列(slipperysequence)及其下游的假结(pseudoknot)结构被认为是移码所必需的【19】。多聚蛋白PPlab、PPla经nspla、nsplp、nsp2、nsp4剪切形成至少14个非结构蛋白，包括四个蛋白酶(nspla、nsplD、nsp2、nsp4)，RNA聚合酶(nsp9)，解旋酶(nspl0)以及内切核酸酶(nspll)[14,20-22】。ORF2a、ORF3、ORF4和ORF5分别编码四种囊膜糖蛋白：GP(glycoprotein)2a、GP3、GP4和GP5，ORF2b是编码73个氨基酸的非糖基化结构蛋白Il引。ORF6编码非糖基化的膜蛋白M(membraneprotein)，ORF7编码核衣壳蛋白N(nucleocapsidprotein)。最近的研究显示，在ORF4与ORF5上存在一个新的ORF，命名为ORF5a，1型和2型PRRSV在基因组结构相同，然而其核苷酸60％差异。比较LV和VR2332的氨基酸序列，其一致性仅为：ORF2(63％)，ORF3(58％)，ORF4(68％)，ORF5(59％)，ORF6(78％)，ORF7(65％)123,“1，可见ORF3与ORF5是变异性最大的两个蛋白。 第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白研究进展An3’PRRSVgenometranslation●匝翌酲夏二二二二翌￡lppla(2396／2503aa)匾万殂霁——————————————诵蕊一olabCSPRdRpPPladf3854／3960aaJlP仅P6PH翻二粕eIfaaJ—j■苓■————虿—r—1■1f幻广—一1——玎L】tJl___-__--____-_一nsp：钯筇234567．89101112a廿图1．1PRRSV基因组结构口5】Fig．1-1PRRSVgenomeorganization1．4病毒基因组编码的结构蛋白同大部分套式病毒一样，PRRSV利用不连续性转录(discontinuoustranscription)机制形成亚基因组mRNA(sgmRNA)。这种特殊的转录方式能够首先合成一套具有相同3，末端的亚基因组“mRNAbodies”，再通过不连续性跳跃，与病毒基因组5’端的非翻译区(UntranslatedRegion，UTR)合成完整的亚基因组mRNAs(SgmRNAs)用以翻译病毒的结构蛋白，5’共末端序列称为“前导序列(LeaderSequence)”[25-27]。其中，前导序列和3’末端亚基因组mRNAs的连接点由一保守的连接位点(Junctionsite，JS)称为TRS序列(5，．UUAACC．3，)【28】。TRS序列同时存在于先导序列的3’端以及基因组中下游的每个ORF的5’端。动脉炎病毒基因组采用产生一系列亚基因组(subgenomicmRNA，sgmRNA)的方式表达结构蛋白(图1．2)瞄，驯。PRRSV基因组近37端结构蛋白编码区域编码GP2(ORF2)，GP3(ORF3)，GP4(OI强4)，GP5(ORF5)，M(matrixprotein)(ORF6)，N(nucleocapsidprotein)(ORF7)以及小结构蛋白2b(ORF2b)【14，16m，301。GP2、GP3、GP4和GP5为定位于病毒囊膜的糖基化蛋白；M、2b、ORF5a蛋白为病毒囊膜上非糖基化蛋白。这些结构蛋白对于病毒复制均为必须的【31】。其中GP2，2b，GP3和GP4在病毒囊膜上的含量比较少，称为少量囊膜蛋白。它们在以前的研究中证实形成多聚体并且在动脉炎病毒入侵细胞中起重要作用[3]-35】。由于GP2和GP4包含病毒粒子与细胞受体结合的功能区，推测GP2和GP4可诱导产生保护性免疫反应。以前研究表明，病毒的受体结合蛋白可以诱导高水平的 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究保护性抗体【361。以前的报道证实，GP4有一个诱导中和性抗体产生的表位【371。PRRSV的少量囊膜蛋白在诱导保护性免疫反应的机制还需要进一步解析。病毒的受体结合蛋白在保护性免疫中的重要作用已在多种病毒中证明，如：丙肝病毒(hepatitisCvirus)【38】、SARS病毒(severeacuterespiratorysyndromevirus)【”J、流感病毒(influenzavirus)、副粘病毒(paramyxovirus)[401等。GP2与GP4是I型跨膜蛋白，由于蛋白表面分别有2个和4个N一糖基化位点使其分子量分别为29．30kDa和30．35kDa。它们N端具信号肽序列，C端锚定在膜上。GP3是一个有七个可能的N．糖基化位点高度糖基化蛋白，分子量约为45．50kDa的【41，421。在l型和2型PRRSV中小囊膜蛋白2b分别由73和70个氨基酸组成【31，431。其中GP2，GP3和GP4在没有2b蛋白的帮助下无法形成功能完全的多聚体【31】。2b蛋白镶嵌在病毒囊膜中可能起到有离子通道的作用，促进病毒粒子脱壳过程。GP5和M蛋白在病毒囊膜中含量比较多，被称为大量囊膜蛋白。GP5和M形成异源二聚体对病毒组装和感染性都是必需的【31l。GP5与M蛋白之间存在二硫键介导的相互作用且被认为是诱导机体产生中和抗体的主要部分Ij引。GP5分子量约为20kDa，N端可能是由32个氨基酸组成的信号肽【州。C端的膜内结构域(endodomain)有50--72个氨基酸【451。N蛋白是病毒粒子中含量最高的蛋白，其主要功能是包装基因组RNAl46]。尽管一系列直接或者对比研究证实PRRSV复制所必须的结构与非结构蛋白，但是PRRSV病毒毒力决定区、发病机制和保护性免疫反应的发生等方面仍没有研究的十分清赳14，47，48]o 第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白研究进展A3’n’e哕，嬲PRRSVgenomemRNA，～黝嗍e“㈣蛔汹粼lIpplabl昏一l乜叵i}三至三三互薹囹s卅u，b月g“esn—so，m，．口e圩-ldeng‘车I◆詹rc．J，b，．捌口，f。月：￡嚣^e。s3i“s“”“盈l__!!：：二#I扣禹磊而丙磊蕊面赢_——¨中【瞳J生竺竺型竺!m月suMbge帮nmomi麟cl1Irp而面川assemblyandrelease●■lproteinslsubgenomtcX。盯mRNAtran,slation、图1-2PRRSV蛋白及病毒RNA合成‘25】Fig．1-2OverviewofthePRRSVreplicativecycleinviralRNAandproteinsynthesis．1．5病毒侵入细胞及病毒粒子包装出芽机制病毒侵入细胞是病毒复制的第一步，明确该过程将极有利于人们预防和控制病毒感染[49'501。自PRRSV被发现时起，人们就开始关注动脉炎病毒侵入细胞这一过程并取得了一定的认识，但是至今仍然没有得出确切的结论【5¨。当前研究结果提示：唾液酸粘附素和CDl63分子在病毒进入细胞的非易感过程中联合起作用，唾液酸粘附素是病毒结合并进入细胞的受体分子，CDl63分子参与病毒的侵入和脱壳过程【52】。而PRRSV囊膜表面的结构蛋白功能当前并没有完全阐明，因此，解析清楚PRRSV囊膜表面蛋白的结构与功能以及其在临床中流行变异特点，正成为病原与宿主间相互作用研究的热点，对抗病毒研究具有重要理论意义及应用前景。Das等研究表明，PRRSV的结构蛋白中GP4和GP2蛋白与其它的糖基化结构蛋白有相互作用；GP4蛋白介导 猪繁殖与呼吸综合征病毒OPm5a蛋白结构与功能的研究少量囊膜蛋白多聚体的组装和介导和大量囊膜蛋白之间的相互作用(GP5)；GP4和GP2蛋白和病毒入侵细胞的受体CDl63相互作用1531。这个结果说明GP4蛋白在病毒囊膜蛋白之间相互作用和病毒入侵细胞过程中起重要作用。虽然少量囊膜蛋白对于病毒粒子的包装是非必需的【541，在病毒粒子上只有为数不多的少量囊膜蛋白多聚体【551。这个结果暗示少量囊膜蛋白与大量囊膜蛋白在病毒囊膜形成的多聚体可以与细胞上特异受体相互作用在病毒入壳中起重要作用。GP5和M蛋白的异源二聚体分散在病毒囊膜上【5引，在病毒组装过程中起重要作用。另外，GP5和M蛋白可以与细胞表面的肝素样受体非特异性结合【561，这种非特异性结合可以辅助GP4和GP2蛋白和病毒入侵细胞的受体CDl63结合。悯酬。pI姗墨g帅b嗍PRRSVenvelope图1．3PRRSV囊膜蛋白相互作用示意Iilt53】Figl-3ApreliminarymodelofthePRRSVenvelopeproteincomplexanditsinteraction动脉炎病毒的组装是首先结构蛋白聚集在胞内膜上通过向高尔基体或者内质网腔隙(1umen)中出芽的方式完成病毒粒子组装【57‘591。当前研究表明，动脉炎病毒的GP2，2b，GP3和GP4少量囊膜蛋白主要定位于感染细胞的内质网，暗示这些蛋白之间的相互作用关系【印】。在EAV中，2b蛋白发现定位于感染细胞的高尔基体和内质网膜上130】。以前研究表明，2b可以帮助GP2，GP3和GP4蛋白组成功能完全的的多聚体；GP2，2b，GP3和GP4组装完成后后由细胞的内质网转运至高尔基体131|。另外，研究报道2b蛋白和M蛋白有共定位关系，且M蛋白可以改变2b蛋白在细胞中的定6 第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白研究进展位，暗示2b蛋白在包装出芽过程中需要M蛋白的帮助。在没有ORF2a-4的情况下，GP5、M和N蛋白可以形成病毒样粒子【54,61,62】。2PRRSVORF5a蛋白研究进展动脉炎病毒为有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小为13．16kb，直径约为60nm。动脉炎病毒基因组中存在大量的重叠序列(Overlappingcodingsequences，CDs)，这表明强烈的选择压力使RNA病毒基因组以最小的基因序列承载最大的编码及调控信息。重叠序列在RNA病毒中普遍存在，但是很难被发现，尤其是较短的重叠序列。前人使用过大量的计算机方法研究RNA病毒基因组中的重叠基因，他们检测到在动脉炎病毒中有一个新的很短的ORF与ORF5的5’端重叠，后来又通过各种生物信息学手段及实验验证阐述了ORF5a在动脉炎病毒中的重要性。2．1生物信息学分析在动脉炎病毒科中，ORF5a基因首先在使用基因搜索软件MLOGD对2型PRRSV进行序列比发现[63-65J。MLOGD软件分析潜在ORF的原理是利用核苷酸和氨基酸置换矩阵的方法通过进化分析预测双编码区、单编码区及非编码区的基因。当这个软件通过分析基因组重叠序列中编码和非编码ORF的特点来预测其中潜在的ORF。对2型PRRSV进行序列分析时，MLOGD软件以动脉炎病毒基因组为对照时检测到ORF5a编码。预测结果显示，2型PRRSV(NCBI中序列号为NC00196I)的ORF5a包含51个氨基酸，与GP5的5’端的48个氨基酸重叠的+2读码框中，重叠区约占ORF5基因的24％。ORF5a的起始密码子在OI心4的3’端终止密码子之后，在ORF55’端起始密码子之前10个核苷酸处。MLOGD对I型PRRSV、EAV及LDV进行ORF的基因组分析，在这些基因组中也可以预测到ORF5a。由于目前仅有一条SHFV基因组序列，不能用MLOGD软件分析ORF5a的编码信号。各种计算机软件预测的结果是EAV的ORF5a含有59个氨基酸，I型PRRSV含有43个氨基酸，II型PRRSV的ORF5a含有51或46个氨基酸，LDV含有47个氨基酸，SHFV含有64个氨基酸。2．2ORF5a蛋白和GP5可能由同一个亚基因组mRNA编码在EAV和2型PRRSV中，亚基因组5的转录调控序列在ORF5a起始密码子上 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究游，可以很好的启动ORF5a蛋白的翻译，并且其中也没有其他起始密码子的干扰mJ。从另外一个方面看，在PRRSV-EU、LDV、SHFV中ORF5a起始密码子与ORF5起始密码子距离几个核苷酸，两者都在亚基因组5的转录调控序列控制下。在真核细胞中，翻译起始的效率受起始密码子附近的核苷酸调控。单股正链RNA病毒的翻译表达模型、有帽子依赖核糖体扫描模型；IRES：渗透扫描(Leakyscanning)模型。在PRRSV中，可能这几种机制同时发挥着作用，特别是在渗透扫描(Leakyscanning)模型中，真核细胞中进行翻译的起始部位共有序GCCACCAUGG，即Kozak序列。Kozak的分析表明在哺乳动物细胞中读码框的+4位置的G和．3的嘌呤有助于读码框的翻译。其中．3的A调控读码框翻译作用最强【67】。当转录出的信使RNA中第一个AUG非最优表达，那么下游AUG翻译【67】。在动脉炎病毒亚基因组5中，ORF5和ORF5a在+4位置上均没有G而ORF5在．3位置上均为A，ORF5a则为嘧啶(EAV、PRRSV-NA、SHFV)或者G(PI汛SV-EU、LDV)。因此，在动脉炎病毒科中，0IU5a起始密码子不是最优选的起始密码子，不会影响ORF5的翻译。另外，在动脉炎病毒基因组中，ORF5和ORF5a的起始密码子距离非常近(距离2～7个碱基)，有研究表明两个起始密码子距离10个碱基内，将会优先翻译下游ORFl6引。对Genbank中10800条ORF5a／ORF5序列分析发现，ORF5a的起始位点和氨基酸序列非常保守。其中在2型PRRSV中51aa的ORF5a约占26％，46aa的PRRSV约占74％。在分析中也有极少数发现ORF5a读码框起始密码子及终止密码子错误的序列，但这些序列不具有代表性，可能是扩增的缺陷病毒的序列。同样在GP5中也有相似缺陷序列【l¨。ORF5a蛋白是动脉炎病毒发现的第8个结构蛋白。在EAV中，ORF5a基因已经在计算机分析、保守型、生物学功能等方面证实存在。ORF5a基因与ORF2b基因相似，它们的翻译都是在同一个亚基因组中利用核糖体寻找起始密码子的特点翻译两个结构蛋白130】。另一个令人感到惊讶的相似之处是，在EAV、PRRSV-NA中ORF5a起始密码子在GP5基因之前，而在其它动脉炎病毒科病毒中在GP5基因之后。这种相似之处揭示动脉炎病毒基因组3’端的进化特点，特别是考虑进这种进化优化亚基因组合成和蛋白表达水平。在EAV中，GP4、ORF5a、GP5三个结构蛋白重叠编码的方式暗示RNA病毒在选择压力下压缩编码序列使整个基因组变小。2．3ORF5a蛋白在EAV中的功能研究在EAV全长感染性克隆中敲除ORF5a实验证实，在细胞致弱毒株感染BHK-21 第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白研究进展细胞拯救出的子代病毒中没有影响病毒RNA的合成，但是严重影响了病毒复制(多步生长曲线最高点与野毒相比低100倍)，病毒空板明显的比野毒株小；在强毒株上敲除ORF5a感染马肺动脉炎细胞也重复出类似结果【l71。在只突变一个点敲除ORF5a的突变体中发现恢复突变现象。在表达ORF5a的细胞株系中拯救敲除ORF5a的EAV发现，病毒的空斑虽然没有与野型毒株完全一样，但是空斑明显增大，病毒滴度也提高了5倍。这个互补实验充分说明EAV的ORF5a蛋白在病毒复制过程中起重要作用，而非敲除突变影响病毒RNA未知信号序列。在以前的研究中由于ORF5a的存在未知，在这一基因区间的操作可能影响到ORF5a蛋白。例如：在ORF4／ORF5之间插入24．m外源序列，现在看来这个插入正好在ORF5a蛋白里【69，701。这个插入将ORF5a蛋白Asp．12突变为Ala和Tyr-15突变为Cys．Glu．Leu．Lys．Gin．His．Ala-Val．His这一序列。从结果上看，病毒可以承受这种改变。与此相似的是，JXAl在传代过程中ORF4／ORF5之间插入12．nt，这个插入将ORF5a蛋白N端Met突变为Phe后插入序列Ala-Arg．Ser-Leul7¨。另外一方面，在EAV24．nt插入突变株基础上插入GFP[70域者GP5囊膜外序列【72J都影响到了ORF5a蛋白。事实上，这些不稳定或者致死突变株有一部分原因在于对ORF5a蛋白的影响。在动脉炎病毒科中，ORF5a蛋白氨基酸序列保守性不好，另外也缺乏蛋白功能预测的数据库，使得推测其功能的难度较大。从EAV病毒缺失ORF5a蛋白的实验结果上分析，ORF5a蛋白的缺失对病毒RNA合成的影响有限，推测其可能为病毒的附加组成部分。ORF5a蛋白的疏水跨膜区可以使自身组装于病毒的囊膜上。从另外一个角度看，在EAV中敲除其余7个结构蛋白对病毒是致死的，暗示ORF5a蛋白在EAV中的作用在与其它结构蛋白不同的功能类别。2．4检测病毒粒子中的ORF5a蛋白PRRSV病毒粒子采用蔗糖密度梯度离心法【4l，。73J纯化以研究病毒组成成分的实验中对病毒粒子质谱分析时发现了51aa的ORF5a蛋白，但由于病毒粒子纯度不够，在其中也检测到了细胞的成分。在接下来，病毒感染细胞上清采用聚乙二醇沉淀再采用CsCl梯度离心法纯化病毒粒子，采用同位素定量分析(iTraq)纯化的病毒粒子检测到51aa的ORF5a蛋白。在过纯化的病毒粒子或者PRRSV感染的细胞裂解液中用ORF5a的抗体可以检测到ORF5a蛋白。但是目的条带都在10KDa处，而预测ORF5a蛋白的分子量为5926Da。带有myc和his标签的重组5a蛋白的分子量也为大约10KDa，推测ORF5a蛋白可能具有翻译后修饰作用。在纯化病毒粒子及MARC．145重组表达的ORF5a蛋白均检测到以二聚体形式存在【l8，74J。9 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究2．5ORF5a蛋白在感染细胞中的表达及定位特点ORF5a蛋白PRRSV感染眦C．145细胞24．28小时能够检测到ORF5a蛋白。在PRRSV感染MARC．145细胞后6小时检测到稀疏的荧光，12．24小时在细胞核周隙(perinuclear)检测到点状荧光，在细胞膜上或附近也可看到点状分布，这种荧光与N蛋白的细胞质分布区别明显[181。而在最近一项研究揭示，在PAM细胞中表达ORF5a蛋白发现，ORF5a蛋白在细胞浆中均匀分布，没有出现重点定位在细胞核周隙(perinuclear)及细胞膜上或附近的现象【741。由于两个实验在不不同条件下得出，ORF5a蛋白的具体定位还有待进一步研究。2．6ORF5a蛋白的免疫学研究为了确定ORF5a蛋白是否在PRRSV感染猪后产生抗体，Johnson设计试验证明PRRSV感染猪体后可以产生针对ORF5a蛋白的抗体。在感染4周后可以检测到特异性抗体，感染7周后抗体达到高峰且以后处于平台期。与PRRSV其它蛋白相比，ORF5a蛋白的抗体产生较晚其产生规律与nsp4类似，在体液免疫反应中只是微量组分。ORF5a蛋白在病毒颗粒和感染的细胞存在很少，ORF5a蛋白可能主要介导的是细胞免疫。2．7ORF5a蛋白的序列分析SOSUI预测PRRSVVR2332的ORF5a蛋白为I型跨膜蛋白，包含一个cc螺旋和一个跨膜团75刁‘¨，包括N端的膜外区(5．12aa)、C端的膜内区(13．31aa)和中间(It螺旋疏水跨膜区。ORF5a蛋白的29位和30位是半胱氨酸，位于跨膜区的内部边缘。它们可能形成二硫键，但在PAM细胞中表达ORF5a蛋白发现这两个半胱氨酸没有形成二硫键【74，78‘791。ORF5a蛋白C端有一个高度保守的富含谷氨酰胺和精氨酸的RQ基序，蛋白序列同源对比、区域对比及二级结构元件分析并没有将其归于已知蛋白家族中【80】，因为其富含碱性氨基酸推测其参与RNA结合、调节mRNA的剪接、转运与包装【8l'82】。PRRSVORF5a蛋白C端存在5个氨基酸的差异，QLDAM的存在与否导致PRRSVORF5a蛋白长度不等，即2型PRRSV的5a蛋白包含46个或51aa。从PRRSV生物学系统发育上看，ORF5a蛋白C端的5个氨基酸的差异并未对PRRSV生物学系统发育上的影响，因此推测QLDAM对PRRSV作用不重要。Hart等将JXA—l传至第80代，在ORF5a内部有4个氨基酸的插入，暗示5a蛋白胞外区的长度改变对ORF5a10 第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白研究进展蛋白的功能影响较小【7l】。2．8ORF5a蛋白对PAM细胞蛋白表达的影响亚基因组ORF5编码病毒的主要囊膜蛋白GP5，同时也是病毒变异比较大的结构蛋白抑制细胞抗病毒免疫反应，促进自身的复制。所以，研究宿主细胞在病毒感染后基因表达的差异可以很好的阐明病毒的致病机制。应用蛋白组学的研究手段揭示，在表达ORF5a的PAM细胞中共有16种蛋白差异表达【74。。这些蛋白参与调节细胞的生长、细胞骨架的形成、细胞信号传递、新陈代谢、蛋白质的合成、RNA加工以及转录等方面调控。ORF5a蛋白对宿主细胞这些基因的影响可能暗示着其在病毒复制过程中的功能。病毒一般利用细胞内的两种转运策略：一是细胞质膜运输，另外一种是细胞支架蛋白网络系统转运。该研究揭示ORF5a蛋白可以影响四种细胞支架蛋白：波形蛋白(vimentin)，微丝切割蛋白(adseverin)，埃兹蛋白(ezrin)和根蛋白(radixin)。波形蛋白(vimentin)是细胞中间丝蛋白中的一种主要细胞骨架蛋白，它在PAM细胞表面含量丰富且可能介导PRRSV进入细胞的细胞受体蛋白【83J。最新研究表明：PRRSV感染过程中可以增加PAM细胞表面波形蛋白的表达阱，851。然而，单独表达ORF5a蛋白的PAM细胞却表现出在表达初期24h上调波形蛋白表达接下来48h检测时，波形蛋白表达下调。这个结果暗示PRRSV的其它蛋白也参与了调控波形蛋白表达过程。ORF5a在初期对波形蛋白表达的上调作用，可以加快病毒复制过程。在表达ORF5a的PAM细胞中微丝切割蛋白(adseverin)的表达几乎完全被抑制。微丝切割蛋白是一种钙依赖性肌丝切割蛋白(Ca2+_dependentactinfilament．severingprotein)，定位于细胞骨架通过改变细胞膜下面微纤丝的结构来调节细胞的外分泌№6。。由此推断，ORF5a蛋白在病毒复制过程中通过调节微丝切割蛋白的表达调控细胞的分泌系统。与此相反的是，另外两种细胞骨架蛋白埃兹蛋白(e面n)和根蛋白(radixin)在表达OI强5a蛋白的PAM细胞中明显上调。它们是肌动蛋白结合蛋白通过介导丝状肌动蛋白和细胞膜的相互作用组成皮层细胞骨架，并且通过它们可以与跨膜受体和下游信号分子相互作用协调细胞信号通路【871。总的来说，ORF5a蛋白对细胞骨架蛋白的改变暗示病毒感染与复制过程对细胞骨架及信号传递的改变。有趣的是，在表达ORF5a的PAM细胞中核糖核蛋白(bnRNP)A1和K的上调表达。hnRNPA1在PRRSV感染后会出现上调表达，而hnRNPK在PRRSV感染后会出现下调表达。hnRNP蛋白家族包含一组可以与RNA聚合酶II转录产生的不均一核糖核酸(heterogeneousnuclearRNA，hnRNA)相互作用的多肽。这些蛋白参与调节mRNA转录、pre．mRNA的处理和成熟mRNA从细胞核到细胞质的转运。以前研 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究究表明，ImRNPAI可以辅助丙型肝炎病毒、鼠肝炎病毒、水泡性口炎病毒等的复制。PRRSV感染PAM细胞的蛋白组学表明，hnRNPs蛋白家族的A1，A／B，H调高表达暗示hnRNPs蛋白家族在PRRSV复制过程中的辅助作用瞰J。另外，ORF5a蛋白C端存在一个高度保守的R／Q基序【18】。这种基序主要与RNA相互作用，调控mRNA剪辑与转运。因此，ORF5a蛋白通过调控hnRNPs蛋白家族调高病毒RNA剪辑、转录或者包装的效率来促进病毒复制。在表达ORF5a的PAM细胞中，直接或者间接参与细胞代谢调控的蛋白也检测到表达差异。其中有6个蛋白上调表达，丙酮酸脱氢酶复合体E2(PDC．E2)，丝氨酸蛋白酶抑制剂B1(SerpinB1)，三功能性的嘌呤生物合成的蛋白质腺甘酸．3(trifunctionalpurinebiosyntheticproteinadenosine．3)，葡萄糖磷酸脱氢酶l(G6PD)，O．N．乙酰氨基葡糖(O．GlcNAc)转移酶(OGT)和ATP柠檬酸裂解酶。PDC．E2是丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)的组成部分，它通过丙酮酸脱羧途径催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A。丝氨酸蛋白酶抑制剂B1(SerpinB1)在流感病毒感染过程中起抑制炎症反应和促炎症反应细胞因子产生起关键作用。三功能性的嘌呤生物合成的蛋白质腺甘酸．3(trifunctionalpurinebiosyntheticproteinadenosine．3)由GART基因编码，在嘌呤生物合成过程中为一个三功能性多肽。G6PD是一个关键的调控酶与辅酶(NADPH)起协同作用，在抗氧化作用和还原生物合成反应中作为电子供体。OGT在蛋白合成后可以对丝氨酸和苏氨酸进行糖基化修饰。PRRSV病毒囊膜上有多个糖基化修饰蛋白，ORF5a调高OGT的表达可以促进这些蛋白的糖基化修饰。ATP柠檬酸裂解酶胆固醇和脂肪酸生物合成起催化作用。以上结果阐明ORF5a蛋白对PAM细胞的影响。总的来说，ORF5a对PAM细胞代谢调控的影响可以起到重建细胞内环境以利于病毒复制的作用。病毒作为细胞内寄生的生物，病毒必须进入靶细胞内，并依赖细胞内环境完成复制。因此，病毒感染细胞后也会改变细胞内的环境，以利于自己的复制。为我们进一步研究ORF5a蛋白在病毒复制过程中的作用提供指导。但由于是在过表达条件下进行，ORF5a蛋白的功能并未阐释清楚。2．9结语通过直接分析和对比其它动脉炎病毒的方法，人们对PRRSV蛋白的认识逐渐深化，但PRRSV的毒力决定区域、致病机理和免疫保护仍然未知。我们通过在PRRSVORF4／5基因区间插入操作推测ORF5a基因的存在。随后的研究报道也证实了我们的推论。ORF5a蛋白可能是动脉炎病毒的第8个结构蛋白，在动脉炎病毒的复制过程中12 第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白研究进展起到重要作用，5a蛋白作为一个新发现的结构蛋白，其结构与功能还需更加深入的研究。在本实验室已经拥有的PRRSV全长感染性克隆的基础上，本研究利用反向遗传操作方法对动脉炎病毒的基因转录调控、囊膜蛋白功能等进行了解析，促进了对动脉炎病毒的进一步了解，为防治PRRSV及其它动脉炎病毒奠定了一定的理论基础。 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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究【77]KallL，KroghA，SonnhammerEL．Advantagesofcombinedtransmembranetopologyandsignalpeptideprediction一-thePhobiuswebserver[J]．NucleicAcidsRes，2007，35(WebServerissue)：W429—432．【78]MichelsonS．Consequencesofhumancytomegalovimsmimicry[J]．HumImmunol，2004，65(5)：465-475．[79]WoottonSK，YooD．Homo-oligomerizationoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnucleocapsidproteinandtheroleofdisulfidelinkages[J]．JⅥrol，2003，77(8)：4546—4557．【80]DelvalA，KrystkowiakP，BlattJL，eta1．AbiomechanicalstudyofgaitinitiationinHuntington’Sdisease[J]．GaitPosture，2007，25(2)：279-288．[81]BayerTS，BoothLN，KnudsenSM，eta1．Arginine-richmotifspresentmultipleinterfacesforspecificbindingbyRNA[J]．RNA，2005，11(12)：1848—1857．【82]Tan＆FrankelAD．Anovelglutarnine-心Ainteractionidentifiedbyscreeninglibrariesinmammaliancells[J]．ProcNailAcadSciUSA，1998，95(8)：4247-4252．[83]KimJK，FahadAM，ShanmukhappaK，eta1．Definingthecellulartarget(s)ofporcinereproductiveandmspiratorysyndromevirusblockingmonoclonalantibody7G10[J]．JVirol，2006，80(2)：689—696．[84]LuZ，ZhangJ，HuangCM，eta1．ChimericvirusescontainingtheN—terminalectodomainsofGP5andMproteinsofporcinereproductiveandmspiratorysyndromevirusdonotchangethecellulartropismofequinearteritisvirus[J]．Virology,2012，432(1)：99．109．【85]DingZ，LiZJ，ZhangXD，eta1．ProteomicalterationofMarc-145cellsandPAMsafterinfectionbyporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J]．VetImmunolImmunopathol，2012，145(1-2)：206-213．[86]DumitrescuPeneT，RoseSD，LejenT，eta1．Expressionofvariousscinderindomainsinchromaffincellsindicatesthatthisproteinactsasamolecularswitchinthecontrolofactinfilamentdynamicsandexocytosis[J]．JNeurochem，2005，92(4)：780-789．[87]NeischAL，FehonRGEzrin，RadixinandMoesin：keyregulatorsofmembrane-cortexinteractionsandsignaling[J]．CurrOpinCellBiol，2011，23(4)：377-382．20 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究摘要：为解决当前PRRSV弱毒疫苗无法区分野毒感染和疫苗接种的问题。实验以JXMl00为骨架构建的全长感染性克隆为基础，在不影响亚基因5结构的情况在ORF4／ORF5区间插入3~6个碱基，构建ORF4／ORF5区间基因插入突变克隆pAJXMin3、pAJXin4、pAJXMin5、pAJXMin6。通过转染BHK．21细胞进行病毒拯救，发现插入3或6个碱基病毒可以拯救而4或5个碱基不能被拯救。对插入突变致死的突变体分析发现可以检测到亚基因组5、6、7的转录及GP5、N蛋白的表达，说明突变没有影响病毒亚基因组转录和下游基因表达。通过对ORF4／ORF5区间序列分析发现其中存在潜在ORF5a，推测ORF5a蛋白为PRRSV复制过程所必须。本研究在2型PRRSVORF4／ORF5区间中，成功插入阳性基因标识，为创制新型基因工程标记疫苗奠定了基础。关键词：PI汛SV；OI强4；ORF5；外源基因插入猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是一种以怀孕母猪繁殖障碍及新生仔猪严重呼吸系统疾病等临床症状的一种疾病。自上世纪90年代初在欧洲和北美爆发以来，该病对世界养猪业造成严重的经济损失uJ。在美国该病造成的损失每年超过5．6亿美元【2】。2006年，高致病2型PRRSV给中国养猪业造成巨大损失【3】。该病病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为单股正链RNA病毒，它与马动脉炎病毒(Equineartefifisvirus，EAV)，小鼠乳酸脱氢酶升高症病毒(Lactatedehydrogenase-elevatingvirus，LDV)，以及猴出血热病毒(Simianhemorrhagicfevervirus，SHFV)同属于套式病毒目动脉炎病毒科【4】。PRRSV可分为两个基因型，以LV株为代表的欧洲型(1型)和以VR2332为代表的北美型(2型)，两种基因型相似性仅为60％15，61。PRRSV基因组为长度-15Kb单股正链RNA，包括5’端和3’端的非编码区、ORFla和ORFlab编码的复制酶类、及其基因组近3’端至少7个开放阅读框编码病毒的结构蛋I兰t[4'7。10】。PRRSV基因组采用产生一系列亚基因组(subgenomicmRNA， 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究sgmRaNA)的方式表达结构蛋白【lI，121。PRRSV基因组近3’端结构蛋白编码区域编码GP2(ORF2)，GP3(ORF3)，GP4(0I江4)，GP5(ORF5)，M(matrixprotein)(OI强6)，N(nucleocapsidprotein)(ORF7)以及小结构蛋A2b(ORF2b)14，7。10J。其中GP2，2b，GP3和GP4在病毒囊膜上的含量比较少，称为少量囊膜蛋白。它们在以前的研究中证实形成多聚体并且在动脉炎病毒入侵细胞中起重要作用【l孓171。GP5在病毒囊膜中含量比较多，被称为大量囊膜蛋白。GP5与M蛋白之间存在二硫键介导的相互作用【141。N蛋白主要为病毒核衣壳组成部分且可以定位于细胞核中【18J。当前PRRSV在临床流行广泛，我们在研制新一代细胞致弱毒株JXil00过程中发现在nsp2区域存在88个氨基酸的缺失且这个缺失可以在血清学水平上与野毒感染区分。我们结合实验室在另一株2型PRRSV弱毒株(Genbank登录号：GQ330474)的感染性克隆pAPRRS的研究进展1191。我们实验室以前研究发现是在ORF4／5间隔序列之前可以插入13个核苷酸；在间隔序列之后可以插入3个核苷酸，而间隔序列之间可以插入18个核苷酸。在另一株细胞传代致弱JXAl中，间隔序列之间有12个核苷酸的插入【201。这些结果暗示PRRSVORF4／5基因区间允许外源基因插入。但对插入基因序列特点并不清楚。为解析2型PRRSVORF4／5基因区间插入序列特点以及在以JXMl00为骨架构建的感染型克隆pAJXM中加入基因标识。我们在不影响sgmRNA5结构的情况下，ORF4／ORF5区间插入3-6个碱基。通过转染BHK．21细胞进行病毒拯救，发现插入3或6个碱基病毒可以拯救而4或5个碱基不能被拯救，且拯救出突变病毒与亲本毒生长特性相似。通过对ORF4／ORF5区间序列分析发现其中存在潜在ORF5a，推测插入4或5个碱基突变体影响该基因而不能拯救。本研究在2型PRRSVORF4／ORF5区间中，成功插入阳性基因标识，为创制新型基因工程标记疫苗奠定了基础。1材料与方法1．1质粒、细胞和抗体2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染性克隆pAJXM根据JXMl00序列构建(GenBank登录号：GQ475526)由本实验室构建并保存。仓鼠肾传代细胞BHK-21(CCL．10)购自美国ATCC，由本实验室保存。非洲绿猴肾传代细胞MARC．145由本实验室保存。大肠杆菌TOPl0感受态购白天根生物科技有限公司。特异性识别两种基因型猪繁殖与呼吸综合征病毒N(nucleocapsid)蛋白的单克 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究隆抗体(1AGl1)由西班牙雅雷萨生物公司惠赠(IngenasaCompany，Madrid)；特异性识别2型PRRSVGP5单抗由上海兽医研究所童光志老师惠赠。二抗为AlexaFluor-568羊抗鼠IgG，购Invitrogen公司(USA)。1．2主要试剂盒DNA片段快速胶回收试剂盒购白(上海)华舜生物工程有限公司。小量质粒快速提取试剂盒购自(上海)华舜生物工程有限公司。QIAprepSpinMiniprepKit质粒提取试剂盒，病毒RNA提取试剂盒均购自德国QIAGEN公司。1．3主要生化试剂普通TaqPCRMix购自天根生化科技(北京)有限公司。高保真DNA聚合酶(pfuUltraIIFusionHSDNApolymerase)购自Stratagene公司。T4DNA连接酶与限制性内切酶均购I刍NewEnglandBiolabs(北京)有限公司。禽源反转录酶(AMV)购自宝生物工程(大连)有限公司。Trizol、DMEM、OPTI—MEM、2×MEM均购自Invitrogen公司。转染试剂LTX&PLUS均购!111nvitrogen公司。细胞培养级水(HyPurecellCultureGradeWater)购I!IHyclone公司。磷酸盐缓冲液(PBS)与胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司。Tris碱、EDTA、低熔点琼脂糖均购EIPromega公司。琼脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物均购flOXOIn公司。IPTG、X—gal、氨苄青霉素(Amp)、卡钠霉素(Karl)、溴化乙锭(E．B)、MEM培养基干粉均购自Sigma公司。其余常见化学试剂如甲醇、氯化钠、氯仿、甘油等均为分析纯级产品。1．4主要实验仪器荧光倒置显微镜购自Olympus公司；生物安全柜，超净工作台购自上海三超净化设备有限公司；普通离心机，Minispind、型离心机购flEppendorf公司；生化培养箱购自上海医疗器械七厂；DNAThermalCycler480PCR仪购自美国PERKINELMER公司；低温冷冻离心机购白Sigma公司；掌上离心机购自TaKaRa-TOMY公司；紫外分光光度仪NanoDropND．1000型购圭IThermoScientific公司；蛋白电泳系统及凝胶成像系统购自美国Bio．Rad公司；37℃恒温培养摇床、高压锅购自江苏太仓实验设备厂；电子天平购自上海康达电子仪器厂；低温冰箱，超低温冰箱购白海尔公司。水平电泳仪购自百晶公司； 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究1．5溶液及培养基的配置(1)含10％FBS的MEMMEMT粉9．669，NaHC031．009力[1／X．适量细胞培养用水(HyPure)，溶解45min，加入在65℃灭活补体30min的FBSlOOmL，充分混匀后用lmol／L的NaOH溶液调pH至7．2，再用水定容至1L，后用0．22m：fL径的滤器过滤，贮存于4"C冰箱备用(2)含2％FBS的MEMMEMq=粉9．669，NaHC031．009)bH入适量细胞培养用水(HyPure)，溶解45rain，加入在65。C灭活补体30min的FBS20mL，充分混匀后用lmol／L的NaOH溶液调pH至7．2，再用水定容至1L，后用0．22m：fL径的滤器过滤，贮存于4"C冰箱备用(3)25MEDTA(pH8．0)称9．3069EDTA，用80mL去离子水溶解，再用NaOH调pH为8．0定容至lOOmL，高压灭—+}·囟。(4)100mg／ml氨苄青霉素(AMP)称取粉状氨苄青霉素lg，10ml去离子水溶解，使用0．229m滤膜过滤除菌，．20。C保存。(5)5×倍TAE缓冲液(母液)称取549Tris-base，先用蒸馏水600ml充分溶解，再加入25MEDTA(pH8．0)20mL和硼酸27．59，，并用冰乙酸调pH值至8．0，后加蒸馏水至1L定容。(6)LB液体培养基称取酵母提取物59，胰蛋白胨109，氯化钠109，力1]800mL去离子水充分溶解后调pH为7．2～7．4，用去离子水定容至1000mL，用移液器分装到试管中(每试管为4mI)，分装后经121℃、20min高压蒸汽灭菌，常温保存备用。(7)含(州P+)LB固体培养基在LB液体培养基中jJ[11．5％的琼脂粉，121℃、20min高压蒸汽灭菌，待其冷却至50℃左右时，按照lgl／ml培养基的浓度JJHA．100mg／mlAMP，轻轻摇动混合后于无菌环境浇铸玻璃平皿(每平皿20m1)，室温冷却凝固后，倒置于4"C保存备用。(8)1％琼脂糖凝胶(含EB)称取19琼脂粉倒入锥形瓶中，加入80mllX的TAE缓冲液，然后加入1×的TAE缓冲液定容至100ml，摇匀加热至充分溶解，待温度降至50。C左右时，用微量移液器加入EBI～2pl，再次混匀，倒入插好梳子的凝胶槽中，室温冷却凝固后备用。24 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究1．6引物合成根据GenBank上公布的JXMl00(登录号：GQ475526)，运用Primer5．0软件设计并由上海捷瑞公司合成一系列引物(表2．1)。引物用无RNA酶的去离子水溶解为100pmol／L的贮存液，使用时稀释为10pmol／L的工作液。贮存液和工作液均保存于-20℃冰箱。 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究表2-1本研究用到的引物Table2-1Primersusedinthisstudy奉引物命名说明：前缀字母F代表正向引物，R代表反向引物，J表示序列来自JXMl00(GenBank登录号：GQ475526)干斜体为引入的限制性酶切位点。1．7连接产物或质粒的转化将感受态细胞从．70。C冰箱取出置于冰上，等待感受态细胞溶解完全，加入连接产26 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究物(10“L)或质粒(19L)，轻微晃动以混匀内容物，冰浴30min后，将离心管放置于4200水浴，热激90s，然后迅速放置在冰上2～3min，期间不要晃动感受态。向离心管中力H900ml无抗LB液体培养基，混匀后放置于37。C恒温摇床培养lh(150rpm／min)。连接产物离,心3500rpm／min离一1二,4min后弃掉上清后重悬沉淀，均匀涂布含抗生素的固体培养基平板；质粒直接I[7,20～30“L至均匀涂布于含相应抗生素的固体培养基平板。1．8PCR产物回收PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后割取目的条带，用华舜公司DNA快速回收试剂盒参照产品说明书进行回收。具体步骤如下：(1)尽可能最小的切下含目的DNA的琼脂糖胶块，放入1．5ml离心管中；(2)按每100mg琼脂糖加入3009LS1液的比例将S1液加至离心管。在65"C干浴锅内溶化10分钟，每2分钟进行一次颠倒混匀以使琼脂糖块融化完全；(3)将溶化后的S1液转移入吸附柱，12000rpm／min离心lmin。弃掉收集管中液体；(4)将5001xLW1液加入至吸附柱中，12000rpm／min离心30秒。弃掉收集管中液体；(5)将5009LW1液加入至吸附柱中，静置lmin之后，12000rprrgmin离心30秒；(6)12000rpm／min离心2min：(7)将吸附柱移入一个无菌的1．5ml的离心管中，将20I．tL至30“LTl液加至吸附膜中央，室温静置2min之后，12000rpm／min离心lmin。(8)将此含有DNA溶液的1．5ml离心管测定DNA浓度后贮存于．20。C以保存备用。1．9质粒的抽提用于鉴定目的的质粒小量提取试剂盒为华舜公司的质粒小量抽提试剂盒，而用做转染目的的质粒都是使用QIAGEN公司的QIAprepSpinMiniprep试剂盒所抽提。两种试剂盒的工作原理相同，步骤基本相像，以QIAprepSpinMiniprep试剂盒方法为例说明质粒提取步骤：(1)用1．5ml离心管10000rpm／min，离心lmin后弃上清，收集2～3次菌体，加入2509LP1液在细菌沉淀中，振荡至完全悬浮；(2)加入2509LP2液在悬浮液中，立即将离心管颠倒混匀5～10次。室温静置2-4min至菌体裂解完全；27 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究(3)加入350wLP3液在体系中，立即将离心管混匀颠倒5-10次。12000rpm／min离心10min。把上清液小心移入吸附柱内，离心30s。弃掉收集管中液体倒掉；(4)将500wLWl液加入吸附柱中，静置lmin之后，12000rpm／min离心30s。倒掉收集管中的液体；(5)将700pLW2液加入吸附柱，12000rpm／min离心30s。倒掉收集管中的液体；(6)重复步骤5；(7)离心2mira(8)将吸附柱移入灭菌的1．5ml离心管中，将35wL至50此T1液加至吸附膜中央，室温静置2min之后，12000rpm／min离心lmin；(9)测定DNA浓度后放置于．20℃以保存备用。1．10平末端DNA片段连接将纯化回收的平末端DNA片段连接到pCR-bluntII．TOPO载体，反应体系如下：反应成分反应体积(6．0此)saltsolution1．OwLpCR-bluntII．TOPO载体0．6wLDNA片段4．4wL将反应体系混匀后于22。C水浴反应1h。1．11T-A克隆将纯化的含A末端的DNA片段连接到pGEM—T载体，反应体系如下：反应成分10xligasebufferpGEM-T载体连接酶DNA片段反应体积(10．0wL)1．09L7．09L将反应体系混匀后于22。C水浴反应1h。 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究1．12突变体克隆的构建以pAJXM为模板，用表2．1中引物对JFl0959、JMlulR扩增片段，反应体系如下：反应成分去离子水10xbufferdNTP(2．5mM)正向引物JFl0959反向引物JMlulRpfuUltraIIFusionHSDNA聚合酶模板pAJXM(1：10稀释)反应条件为：反应体积(25．0J．tL)17．0肛L2．59L2．01xL0251xL5此5lxL09L95℃lmin95℃3嘶]58℃30secL25循环72℃lminj72℃5minPCR产物经电泳鉴定，纯化回收后经连接、转化、质粒提取(回收方法见2．1．8，连接见2．1．10，转化见2．1．7，质粒提取见2．1．9)构建中间质粒pTOP．AM。经核酸序列测定后以该中间质粒为模板，引物采用表2．1中插入突变引物，进行第二轮突变PCR。反应体系如下：反应成分反应体积(25．OgL)去离子水17．01aL10xbuffer2．59LdNTP(2．5mM)2．0l-tL正向引物0．59L反向引物0．5此pfuUltraIIFusionHSDNA聚合酶0．51xLpTOP-AM模板质粒(1：10稀释)2．09L 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究反应条件为：95℃2min95℃60℃72℃斗懈PCR产物经电泳鉴定后，向其中加入1此DpnI酶在37。C水浴中反应lh以消化模板质粒，后转化大肠杆菌TOPl0(转化见2．1．7)，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基，376C培养12h。挑取疑似菌落，扩大培养后提取质粒(方法见2．1．9)经测序筛选阳性克隆，命名为pTOP—AMin3、pTOP-Amin4、pTOP-Amin5、pTOP—Amin6。以pTOP-AE进行下一步酶切反应，反应体系为：反应成分去离子水10xbuffer4100×BSA彳scIM／uI反应体积(60．09L)36．09L6．09L0．69L1．59L质粒pTOP—AMin3--615．09L混匀后于370C水浴反应2h后进行凝胶电泳，纯化回收目的条带(方法同2．1．8)。同时对全长感染性克隆pAJXM进行同样双酶切，回收目的载体片段。分别将以上两次酶切回收的DNA片段按如下反应进行连接：反应成分反应体积(10．0rtL)10xligasebufferT4DNAligase回收片段载体片段1．09L1．0I_tL1．O此7．01xL连接反应条件为16"C水浴6小时。将连接产物转化TOPl0感受态细胞(方法见2．1．7)，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基培养，挑取疑似菌落扩大培养后提取质粒(方法见2．1．9)，，使用东盛质粒提取试剂盒提取质粒，经电泳鉴定，挑取与阳性质粒大小相同的质粒，测序进行鉴定。将测序鉴定正确的质粒分别命名为，命名为pAJXMin3、pAJXMin4、pAJXMin5、pAJXMin6，放于一20。C备用。 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究1．13全长cDNA克隆的酶切图谱鉴定对构建的全长eDNA克隆进行SmaI酶切图谱分析，反应体系为：反应成分反应体积(20．O此)去离子水10．5“L10×bufferT2．0txL10xBSA2．01xLSmal0．5}tL模板质粒5．0I_tL充分混匀后置于30℃水浴反应3小时后，进行凝胶电泳分析。1．14突变体质粒转染细胞转染之前，先用紫外分光光度计(NanoDropND．1000)测定质粒的浓度。BHK-21细胞待贴壁细胞长满单层约70％左右的时候开始进行转染，以pAJXM做为阳性对照，转染所用试剂为LTX&PLUSreagent(Invitrogen公司产品)，其具体的操作步骤可以参照说明书，主要步骤如下(以下参数均为转染六孔板时使用的试剂量)：(1)稀释质粒：在1．5ml离心管中加入500pL的Opti．MEM液，然后在每个离心管中加入1-2}-tg质量的质粒，用振荡器振荡混匀；(2)将2此PLUS试剂加入离心管，混匀，室温孵育5min；(3)然后将lOlxLLTX转染试剂加入在相应离心管中，混匀，室温孵育30min；(4)取出细胞培养板，每孔加PBSlml洗1次，然后在每孔加入2ml细胞生长液(10％FBS．MEM)，在细胞培养箱中备用；(5)在转染混合物孵育30min之后，将转染混合体加入到细胞中并轻轻晃动混匀，放置于细胞培养箱中孵育；(6)6h～8h后吸除转染混合物，PBS洗涤2次，每孔加入3ml细胞生长液(10％FBS．ⅧM)，培养基于细胞培养箱中培养。1．15间接免疫荧光检测将阳性对照pAJXM、空白对照和所有插入突变克隆转染BHK一21细胞后24h或者病毒感染MARC一145细胞48h后进行N蛋白的间接免疫荧光检测，具体步骤如下(以六孔板为例)： 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究(1)转染24h或者病毒感染细胞约48d,时后，收集细胞上清液，用PBS洗涤小心细胞2次，加入．20℃预冷的甲醇固定细胞(500lxL／TL)，孵育10min；(2)弃去甲醇，用PBS洗涤细胞2次；(3)在每孔加入500此1％浓度的BSA溶液(PBS溶解)在室温下进行封闭30min；(4)弃去BSA，用PBS洗涤2次；(5)加入用PBS稀释的一抗(1：500)在，孵育2h(500}a：孔)；(6)用PBSd"'I)洗涤细胞5次；(7)加入用PBS稀释(1：1000)的带红色荧光素酶标记的二抗在37。C、避光环境下孵育(500pL／#L)lh；(8)弃去上清液，避光环境下PBS洗涤细胞3次。(9)向每孔中加入500皿PBS，在暗环境下于倒置荧光显微镜上观测荧光。1．16病毒传代及细胞上清盲传转染后有CPE出现的样品孔，收取细胞上清液，标记为P0代病毒。P0代病毒用无血清DMEM进行1000倍稀释之后，接种于六孔板MARC．145细胞单层贴壁细胞长满单层约70％。300pL／孑L进行感染，在37。C孵育1h；弃去病毒感染液，每孔用PBS洗涤细胞2遍。每孔加入3ml含2％FBS的MEM，放置于细胞培养箱进行培养，待病变程度达80％，进行细胞上清的收取，标记为P1代病毒。用同样的方法获得P2、P3代病毒。转染后没有CPE出现的样品孔，在转染后第6天进行盲传。取300扯L转染的细胞上清液接种于接种于六孔板MARC一145细胞单层贴壁细胞长满单层约70％，37。C孵育1h之后，弃去接种感染液，每孔用PBS洗涤2遍，每孔加入3ml含2％FBS的MEM，置于细胞培养箱进行培养。1．17病毒上清RNA的提取提取病毒上清RNA的实验，主要参考QIAgenViralRNAMiniKit的使用说明书进行，具体的步骤如下：(1)将融化好的560此AvLBuffer及5．6pLcarrierRNA的加入至1．5ml离心管中，混匀；在其中加入140pL病毒上清，振荡混匀15s；。(2)室温孵育(1)中混合物lO分钟，短暂离心，离下沾在管壁的液体；(3)加入560“L的无水乙醇，振荡混匀15s。短暂离心，以离下沾在管壁的液体；32 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究(4)将630pL步骤3中的溶液小心移取至QIAgenspincolumn，盖好管盖。8000rpm，离心lmin，将QIAampspincolumn放入新的2ml收集管中；(5)重复步骤4；(6)加入500I．tLAWlBuffer；8000rpm，离心lmin；(7)加入500I．tLAW2Buffer；14000rpm，离心3min，换新的收集管；(8)14000rpm，离心lmin；(9)将QIAampspincolumn放入一个灭菌的RNAsefree的1．5ml离心管中，加入60此于室温平衡的AVEBuffer，室温孵育lmin。8000rpm，离心lmin。1．18细胞总对蛆的提取(Trizol提取细胞总RNA)参照英维杰基TRIzolReagent使用说明书提取细胞总RNA，具体步骤如下：(1)以六孔板为标准，每孔加入lmlTrizol，吹打，裂解细胞；(2)将所有细胞总RNA移入1．5mlRNase．free离心管中，室温放置5min；加入2001．tL氯仿，振荡混匀15s，室温静置3min；(3)4"C120009离心15min样品分为三层：下层红色的有机相，中间蛋白层，上层无色的水相；RNA主要在水中，把上层(约为600I-tL)转移到一个新的RNAasefree离心管中；(4)在(3)中得到的溶液中，加入等体积(600I-tL)异丙醇，振荡混匀15s，室温放10min；4"C条件下12000rpm，离心10min，弃去上清可见管底有白色絮状沉淀；(5)加入lml75％的乙醇，振荡混匀，4"C条件下8000rpm离心5min，用枪头吸掉液体，注意不要吸出沉淀；(6)室温放置5．10min晾干，但不要晾的过干；加入30pLRNAasefreewater，反复吹打混匀，以便溶解RNA。(7)55℃，10min后即可得到细胞总RNA。1．19RT-PCR检测病毒基因组及亚基因组1．19．1病毒基因组的检测以上述提取的病毒上清RNA或细胞总RNA为模板，反转录酶按照TAKARA公司的ReverseTranscriptaseXL(AMV)使用说明书进行操作，用设计的引物Qst进行反转录，反转录体系为： 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究删(1NTP5×AMⅣBufferRTPrimer(Qst)RNAsample0．59L29L49LO．5灿13皿20此反应体系，426C孵育1h。反应完成后置于冰水中孵育2min，所得到的反应液即可直接应用于PCR反应。PCR引物为JF．ORF5／JR．ORF5，25止PCR反应体系如下：cDNAsampleJF．ORF5JR．0RF5TaqMixddH20反应条件如下：95℃58℃72℃5min30s1min10min2pLO．59L0．59L12．59L9．59Lt35cyclesPCR产物经电泳后回收目的条带，送测序。1．19．2病毒亚基因组的检测提取出的细胞总RNA先经过反转录获得cDNA。反转录酶按照TAKARA公司的ReverseTranscriptaseXL(AMV)使用说明书进行操作，用设计的引物Qst进行反转录，反转录体系为： 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究AMV5×AMVBufferdNTPRTPrimer(Qst)RNAsampleRNase．FreeH，O0．59L4lxL2lxLO．59L29L1l此20IxL反应体系，42。C孵育lh。反应完成后在冰水中孵育2min，所得到的反应液即可用于PCR反应。PCR引物为JF6与JRl4365、JRl5008、JRl5284(分别对应亚基因组5、6、7)，251xL反应体系如下：eDNAsampleJF6JRTaqMixddH20反应条件如下：2此O．51xL0．59L12．5gL9．51aL95℃5min95℃30s’1l63。C30s卜35cycles72℃30s／72℃lOminPCR产物经电泳后回收目的条带，送测序。1．19．3IB-actin内参扩增提取出的细胞总RNA先经过反转录获得cDNA，以表2．1中所述的actinF和actinR为正反向引物进行13-actin内参扩增，反应体系如下：actinF0．59LactinR0．5taLcDNAs29L2xPCRTaqMix12．59L35 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究ddH209．51．tL总反应体系为25此，PCR循环参数如下：95℃3min95℃30s、l55"C30s}．30cycles72℃20sj72℃10minPCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后使用，确定不同突变病毒cDNA使用量。1．20空斑形态分析(1)P3代的病毒用DMEM进行倍比稀释后，以2001aL稀释液感染六孔板中的MARC．145细胞。(2)37。C孵育1h后，弃掉病毒稀释液，加入等终浓度为含2％FBS的MEM，含1％的琼脂糖。4mL／孔铺进细胞板中。(3)室温凝固后，放置于37"C细胞培养箱倒置培养4．5天，观察。(4)待空斑出现以后，在每个孔中加入2mL4％的甲醛溶液固定1h。甩掉凝胶，后用5％结晶紫溶液(溶于20％乙醇溶液)进行染色。1．2l空斑纯化对于需要进行空斑纯化的病毒，用P3代病毒感染细胞，以2．1．20的方法感染和铺低熔点胶，待空斑出现以后，直接用枪头取单个空斑连同胶一起置于DMEM中。用200“L上清感染MARC．145细胞，室温孵育1h后，加入含2％FBS的MEM培养基。待出现病变以后，收取上清进行RT-PCR检测，通过测序结果确定空斑纯化出的病毒(plaquepurificationvirus，ppv)的类型。’1．22病毒细胞半数感染量(TCIDS0)谀IJ定采用96孔细胞培养板测定病毒对细胞的半数感染量。(1)将待检测病毒液用无血清DMEM培养基作10倍连续梯度稀释。36 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF4／0RF5区间基因插入研究(2)(3)(4)1．23将各个稀释度的病毒液接种于新鲜的MARC．145细胞(96孔板中)，且将每个稀释度重复4孔。在细胞培养箱中作用1小时后吸走上清液，加入含2％FBS的MEM培养基(2009L／孔)维持培养细胞。7天后观察并记录各个细胞孔细胞病变情况。最后用Reed—Muench法计算TCID50。多步生长曲线传代至P3代的病毒以0．01MOI的感染量感染MARC．145细胞，分别在感染后的时间点：12h、24h、36h、48h、60tl、72h、84h、96h、108h和120h收取病毒上清。每次收集2001xL，放于．70。C保存。按照2．1．22的方法测定收取的各个时间点的上清TCID50，并根据计算出的病毒滴度用GraphPad软件绘制出病毒的生长曲线。2结果2．1ORF4／ORF5区间插入突变体的构建如图2—1所示，以pAJXM为模板，利用突变PCR，通过DNA酶切和连接，成功构建在ORF4／ORF5区间序列上，插入3“个核苷酸的4个突变质粒：pAJXMin3、pAJXMin4、pAJXMin5和pAJXMin6。最终获得的一系列全长突变体经过琼脂糖凝胶电泳鉴定及SmalI酶切鉴定正确，且进一步测序结果显示所有插入突变位点均存在，成功构建突变体。 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究5v孤●I3，【玎R一?誊董誊誊i⋯¨i⋯暑≥=_：_=一j__li要量善誊1一一pA删两F———————————一、、～．’I_．--___--_-．．-___________-．．___．_--____---_．--．-_-_________．____________．_．-．_-_-一，删匣三二二二=二二二二二==>pAⅨM融蜀丽丙■———————————、、—～、‘l-__．．-__--___：：_．________．--．-__-__-_____-．-．_-___．．__-___．-_-_．_．．_________-_--．-__．_．-____-_-一，删匦茎互二二二二二二二二=≥删匦歪亟二二二=二二二二二==>图2．1插入突变质粒构建示意图Fig2一lSchematicdiagramoftheinsertionmutantplasmids2．2ORF4／ORF5区间插入突变体的拯救将所有突变体质粒及阳性对照质粒pAJXM转染BHK．21细胞，转染后24h进行针对GP5和N蛋白的间接免疫荧光检测。结果显示，所有插入突变体均检测到了GP5和N蛋白的表达(如图2．2所示)。在这之中，各个突变体检测到GP5蛋白的表达量及表达位置与阳性对照无明显差异。在胞浆及胞膜均检测到GP5蛋白的表达；N蛋白的表达量及表达位置与阳性对照也无明显差异，在胞浆及核内均检测到N蛋白的表达。表明在ORF4／ORF5区间插入核苷酸没有影响PRRSVGP5及下游基因的翻译。38 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究aGP5p．AJXMIn3p．hdX,MIn4p．hdX．MinSpAJ心IIn6图2．2缺失突变体N蛋白及GP5免疫荧光分析Fig2-2ImmunofluorescenceanalysisoftheNproteinandGP5ofinsertionmutantplasmids以pAJXM为阳性对照，将所有插入突变体质粒转染BHK．21细胞24h的上清感染MARC．145细胞，pAJXMin3和pAJXMin6分别于转染后第5天观察到细胞病变，如图2．3所示，表现为细胞皱缩、聚集、随着时间延长单层细胞逐渐脱落。收集P0代病毒并命名为vAJXMin3．P0和vAJXMin6．P0。pAJXMin4和pAJXMin5感染MARC．145细胞后，没有出现病变。感染后的上清连续盲传三代也未出现细胞病变，接下来进行三次重复实验结果一致。表明在ORF4／ORF5基因区间可以插入3或者6个核苷酸而4或者5个核苷酸插入则影响病毒感染性。pAJXMpAJ'XMIn3p．^J：l(^lln4pAJXMIn5pAJXMIn6图2—3系列插入病毒及亲本病毒接种MARC一145产生的CPEFig2-3CPEofvAJXMandinsertionmutantvirusesonMARC-145对于无感染性的突变体，进一步分析这些连续缺失区域到底是影响了病毒复制的哪个过程。从间接免疫荧光的结果上看，插入突变体GP5及下游蛋白表达没有受到影响，进一步分析了突变体亚基因转录的情况。根据动脉炎病毒特定的转录模式，利用已报道的方法能够通过RT-PCR扩增亚基因组mRNA的方法来进行表示[2l’221。将突变体pAJXMin3、pAJXMin4、pAJXMin5、pAJXMin6及野牛型pAJXM转染BHK．21细胞，24h后提取细胞总RNA进行RT-PCR检测sgmRNA5、6、7的转录。如图2—4所39 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究示，所有突变体及野生型pJXM都扩增出了sgmRNA5、6、7目的条带。尽管pAJXMin4、pAJXMin5没有成功拯救出活病毒，仍检测到了亚基因组的转录。对pAJXMin4和pAJXMin5sgmRNA5测序显示，sgmRNA5的TRS没有受到影响(图2．5)。表明pAJXMin4和pAJXMin5的插入没有影响了病毒的亚基因组转录及蛋白翻译过程。sgmlLNA5sgmR_XA6sgmlL＼'A7．∥一，一芦◇图2．4RT-PCR检测突变体正链亚基因组Fig2-4IdentificationofsgmRNAofmutantsbyRT-PCR13393上：▲▲CC穆Tt了室^GeC节6TC彳室T室警GCe▲?Ce图2．5突变病毒亚基因组TRS序列测序结果Fig2-5Resultsofsequencingofthegenomeofmutantviruses2．3ORF4／5区间插入突变病毒的体外生长特性分析2．3．1ORF4／5区间插入突变病毒的多步生长曲线将拯救病毒分别命名为vAJXMin3和vAJXMin6，在MARC．145细胞上连续传代3代，收集每一代次细胞上清，分别获得Pl-P3代病毒。对p3代病毒测序发现插入核 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究苷酸可稳定遗传且在ORF5区域没有发现额外突变。为了研究这些缺失突变病毒在体外的生长特性，选取拯救的突变病毒vAJXMin3．P3、vAJXMin6．P3和野生型vAJX]V[第三代病毒来绘制其多步生长曲线。按照材料与方法的方法，制作其多步生长曲线，如图2-6所示。结果显示，缺失突变病毒的生长特性与野生型vAJX／vI基本一致，这些结果表明ORF4／5区间外源序列对于病毒的复制过程基本无影响。暑孑2三兰乏呈>图2-6ORF4／5区间插入病毒突变体的多步生长曲线Fig2-6Multiple-growthcurveofORF4／5insertionmutantviruses2．3．2ORF4／5区间插入突变病毒的空斑形态为了研究这些缺失突变病毒在体外的生长特性，选取拯救的突变病毒vAJXMin3．P3、vAJXMin6．P3和野生型vAJXM第三代病毒来来进行空斑形态实验。如图2．7所示，从空斑形态大小上看，缺失突变病毒与野生型vAJXM形态基本没有差异，说明插入突变病毒在MARC．145上的复制能力与亲本病毒基本一致。 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究3讨论pAJXM图2．7病毒空斑形态分析Fig2-7Plaquemorphologyanalysisofrescuedvirus我们的实验结果证实，在不影响sgmRNA5结构的情况下，ORF4／ORF5区间插入3～6个碱基。通过转染BHK．21细胞进行病毒拯救，发现插入3或6个碱基病毒可以拯救而4或5个碱基不能被拯救，且拯救出突变病毒与亲本毒生长特性相似。ORF4／5是个很有意思的位点，ORF5是由PRRSV基因组中变异较大的区域。GP2．GP3．GP4．2b可以形成多聚体的形式包装在病毒的囊膜上，GP5与M蛋白可以形成二聚体。暗示ORF4／5之间相关性较弱，而且在2型PRRSV中，ORF4与ORF5没有重叠的编码基因。在另一株高致病性蓝耳病JXAl株的序列分析表明，在其100代传代制弱株发现在ORF4／5之间有12bp的插入；我们实验在另一株2型PRRSVORF4、ORF510bp间隔序列之间插入18个核苷酸，证明ORF4／5可以作为外源序列的插入位点。本研究在2型PRRSVORF4／ORF5区间中，成功插入阳性基因标识，为创制新型基因工程标记疫苗奠定了基础。42 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究CATGAGGTGGGCAACCGTTⅡtS5GUCUUUUUGCCAUCCUACUGGCAAGCGAUUGCUUUUUUUGUGGUGUAUCGUGCCGUUUUAUCUUGCUGUGCUCGUCAACGCCAGCAACAACAACAGCUCUCAUAUUCAGUUGAUUUAUaaCUUAACGCUAUGugaGCUGAAUGGCACAGAUUGGCUGGCACAAAAAUUugaCUGGGCAGUGGAGACUUUUGUCAUCUUCCCCGUGUUGACUCACAUUGUUUCCUAUGGGGCACUCACCACCAGCCAUUUCCUugaCACAGUUGGUCUGGCCACUGUGUCCACCGCCGGAUAUUAUCACGGGCGGUAUGUCUUGAGuagCATTTACGCAGTCTGCGCTCTGGCTGCGCTGATTTGCTTTGTCATuagGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACUaaGGGCAGACTCTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAGGGGGuaaGGTugaGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTugaTGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCTCTAG图2-8亚基因组5分析Fig2-8analysisofsgmRNA通过对ORF4／ORF5区间序列分析发现其中存在潜在ORF5a，推测插入4或5个碱基突变体影响该基因而不能拯救。我们实验室以前得出实验结论ORF4／ORF510bp间隔序列之后只能允许3个核苷酸的插入，间隔序列之间允许18个核苷酸的插入。值得分析的是，结合本次实验结果在ORF4／ORF510bp间隔序列之间或之后，即ORF5的起始密码子之前只允许3、6、12、18个核苷酸的插入。这涉及PRRSV病毒复杂的转录和翻译过程。对于转录过程，我们没有影响到TRS序列，虽然我们改动了TRS周围的序列，有可能影响TRS周围序列的一级结构和二级结构在转录中发挥着作用。但是我们的实验结果证实亚基因组5及其下游基因组的转录并未受到影响。亚基因组5的TRS序列也没有受到影响。对病毒翻译过程分析结果看，GP5及下游N蛋白表达没有受到明显影响。从我们插入及报道的插入序列上看，插入序列均为密码子的倍数。我们重新分析亚基因组，发现在2型PRRSV中ORF5之前存在一个新的ORF，命名为ORF5a，推测这个潜在的ORF对病毒复制所必须。ORF5a起始密码子与ORF5起始密码子距离几个核苷酸，两者都在亚基因组5的转录调控序列控制下。在真核细胞43 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究中，翻译起始的效率受起始密码子附近的核苷酸调控。单股正链RNA病毒的翻译表达模型、有帽子依赖核糖体扫描模型、IRES；渗透扫描(Leagyscanning)模型。在PRRSV中，可能这几种机制同时发挥着作用，特别是在渗透扫描(Leakyscanning)模型中，真核细胞中进行翻译的起始部位共有序GCCACCAUGG幽J，即Kozak序列；Kozak的分析表明在哺乳动物细胞中读码框的+4位置的G和．3的嘌呤有助于读码框的翻译。其中．3的A调控读码框翻译作用最强。当转录出的信使RNA中第一个AUG非最优表达，那么下游AUG翻译幽J。在动脉炎病毒亚基因组5中，ORF5和ORF5a在心位置上均没有G而ORF5在．3位置上均为A，ORF5a则为嘧啶。因此，在2型PRRSV中，ORF5a起始密码子不是最优选的起始密码子，不会影响ORF5的翻译。结合我们的实验结果，亚基因组分析及间接免疫荧光结果证明，虽然未拯救出病毒，但是并没有影响到其它蛋白的转录翻译，所以我们推测更大的可能性是这种突变影响了ORF5a的翻译过程，这需要实验数据进一步的说明。 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究参考文献[1】RossowKD．Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome[J]．VetPathol，1998，35(1)：1．20．【2】NeumannEJ，KliebensteinJB，JohnsonCD，eta1．AssessmentoftheeconomicimpactofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeonswineproductionintheUnitedStates[J]．JAmVetMedAssoc，2005，227(3)：385-392．【3]TianK，YuX，ZhaoT，eta1．EmergenceoffatalPRRSVvariants：unparalleledoutbreaksofatypicalPRRSinChinaandmoleculardissectionoftheuniquehallmark[J]．PLoSOne，2007，2(6)：e526．【4】SnijderEJ，MeulenbergJJ．nemolecularbiologyofarteriviruses[J]．JGenⅥrol，1998，79fPt5)(961-979．[5】WensvoortGTerpstraC，PolJM，eta1．MysteryswinediseaseinTheNetherlands：theisolationofLelystadvirus[J]．VetQ，1991，13(3)：121-130．【6】MorrisonRB，CollinsJE，HarrisL，eta1．Serologicevidenceincriminatingarecentlyisolatedvirus(ATCCVR-2332)asthecauseofswineinfertilityandrespiratorysyndrome(SIRS)[J】．JVetDiagnInvest，1992，4(2)：186-188．[7】SnijderEJ，VanTolH，PedersenKW，eta1．Identificationofanovelstructuralproteinofarteriviruses[J]．JⅥrol，1999，73(8)：6335-6345．【8】WuWH，FangYFarwellReta1．A10-kDastructuralproteinofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusencodedbyORF2b[J]．Virology,2001，287(1)：183-191．【9】FirthAE，Zevenhoven-DobbeJC，WillsNM，eta1．DiscoveryofasmallarterivirusgenethatoverlapstheGP5codingsequenceandisimportantforvirespmducfion[J]．JGenVirol，2011，92(Pt5)：1097·1106．[10]JohnsonCR，GriggsTF,GnanandarajahJ，eta1．NovelstructuralproteininporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusencodedbyanaltemativeORF5presentinallartefiviruses[J]．JGenVirol，2011，92(Pt5)：1107—1116．【11]PastemakAO，SpaanWJ，SnijderEJ．Nidovirustranscription：howtomakesense⋯?[J】．JGenVirol，2006，87(Pt6)：1403．1421．[12]SawickiSGSawickiDL，SiddellSG．Acontemporaryviewofcoronavirustranscription[J]．JVirol，2007，81(1)：20—29．[13]FaabergKS，PlagemannPGTheenvelopeproteinsoflactatedehydrogenase—elevating45 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究virusandtheirmembranetopography[J]．Virology,1995，212(2)：512-525．[14]SnijderEJ，DobbeJC，SpaanWJ．Heterodimerizationofthetwomajorenvelopeproteinsisessentialforarterivirusinfectivity[J]．JVirol，2003，77(1)：97-104．[15]WieringaRDeVriesAA，RottierPJ．Formationofdisulfide-linkedcomplexesbetweenthethreeminorenvelopeglycoproteins(GP2b，GP3，andGP4)ofequinearteritisvirus[J]．JV'trol，2003，77(11)：6216-6226．[16]WissinkEH，KroeseMVVanWijkHA，eta1．Envelopeproteinrequirementsfortheassemblyofinfectiousvirionsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J】．JVirol，2005，79(19)：12495-12506．【17]TianD，WeiZ，Zeverdaoven—DobbeJC，eta1．Arterivirusminorenvelopeproteinsareamajordeterminantofviraltropismincellculture[J]．JVirol，2012，86(7)：3701—3712．[18]RowlandRR,KervinR，KuckleburgC，eta1．Thelocalizationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnucleocapsidproteintothenucleolusofinfectedcellsandidentificationofapotentialnucleolarlocalizationsignalsequence[J]．VirusRes，1999，64(1)：1-12．[19]YuanS，WeiZ．ConstructionofinfectiouseDNAclonesofPRRSV：separationofcodingregionsfornonstructuralandstructuralproteins[J]．SciChinaCLifeSci，2008，51(3)：271-279．[20]HanW，WuJJ，DengXYeta1．Molecularmutationsassociatedwiththeinvitropassageofvirulentporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J]．VirusGenes，2009，38(2)：276-284．[21]MengXJ，PaulPS，MorozovI，eta1．AnestedsetofsixorsevensubgenomicmRNAsisformedincellsinfected、析mdifferentisolatesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J]．JGenVirol，1996，77(Pt6)(1265—1270．【22]NelsenCJ，MurtaughMP,FaabergKS．Porcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruscomparison：divergentevolutionontwocontinents[J]．JVirol，1999，73(1)：270—280．[23]KozakM．Emerginglinksbetweenimfimionoftranslationandhumandiseases[J]．MammGenome，2002，l3(8)：401-410． 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4／ORF5区间基因插入研究StudyontheinsertionsequenceofPRRSVORF4／ORF5regionAbstract：Todevelopmentofnovelgenemarkervaccinesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)．Westudiedafull·lengthinfectiousclonepAJXM，whichderivedfromJXMI00．InthisstudyaseriesofmutagensisPCRofailinfectiouscloneofpAJXMwereconducted，differentnucleofideshavebeeninsertedintothedifferentpositionofthespacerof10bpbetweenORF4andORF5．Ourresultshowedthatthespacercallsuffer3or6bpinsertedbetweenthespacer．Growthkineticsandviralplaqueassayinvitroshowedthatthevirologicalcharacteristicsofthemutantvirusweresamiliarwiththewidetypeandthemutantsreplicatedwellasitsparentalstrain．However，thespacercansuffer4or5bpinsertedbetweenthespacer．Thisstudyopensnewpathwaysforthefurtherdevelopmemofnovelgenemarkervaccines．Keywords：PRRSV；ORF4；ORF5；insertionsequence47 第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒OI蹬5a蛋白对病毒感染性影响解析第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白对病毒感染性影响解析摘要：最新研究表明与PRRSV同属动脉炎病毒科的马动脉炎病毒(EAV)ORF5a蛋白对病毒的感染性非常重要但非必需。而我们在对ORF5密码子优化及ORF4／ORF5基因区间插入研究过程中发现破环ORF5a将造成病毒拯救失败。因此，推测ORF5a蛋白在PRRSV复制过程中是必须的。为了进一步验证假设，利用1型(pSHE)和2型(pAJXM和pAPRRS)PRRSV全长感染性克隆，在不影响其它基因编码蛋白及亚基因组二级结构的情况下敲除ORF5a基因，构建全长感染性克隆pSHEk5a、pAJXMk5a、pAPRRSk5a。转染BHK．21细胞，结果突变病毒拯救失败，但是突变体病毒结构蛋白表达没有受到影响。接下来，通过在ORF5a敲除突变体过程中共同转染ORF5a真核表达载体的顺式互补实验证实，ORF5a敲除突变体可以利用顺式表达的ORF5a蛋白，包装出单轮感染性病毒粒子。说明突变病毒致死的原因是没有ORF5a蛋白的表达，证实ORF5a蛋白为病毒感染必须。最后，在pAJXM全长感染性克隆中研究了不同长度ORF5a对PRRSV病毒复制的影响，结果发现46个氨基酸的ORF5a生长速度明显快于延伸后的类型，暗示ORF5a在病毒复制过程中起重要作用。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；ORF5a；感染性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)出现于上世纪80年代末，在欧洲及北美养猪业中造成了严重的猪繁殖与呼吸综合征(PⅪ峪)，以怀孕后期母猪流产、仔猪严重呼吸系统疾病为主要特征Il引。现在，PRRSV已经增强了毒力，在后期怀孕母猪中引起更高的死亡率且感染各个年龄段的猪，已经成为养猪业危害最大的疾病14’引。PRRSV属于动脉炎病毒科，该科病毒基因组均为为单股正链RNA，包括5’端和3’端的非编码区、ORFla和ORFlab编码的复制酶类、及其基因组近3’端结构蛋白编码斟昏10J。动脉炎病毒基因组采用产生一系列亚基因组(subgenomicmRNA，sgmRNA)的方式表达结构蛋白【11，12J。其中GP2，2b，GP3和GP4在病毒囊膜上的含量比较少，称为少量囊膜蛋白。它们在以前的研究中证实形成多聚体并且在动脉炎病毒入侵细胞中起重要作用【l孓17】。GP5在病毒囊膜中含量比较多，被称为大量囊膜蛋白。GP5与M蛋白之间存在二硫键介导的相互作用且被认为是诱导机体产生中和抗体的主要部分49 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究【14】。N蛋白主要为病毒核衣壳组成部分【18】。尽管一系列直接或者对比研究证实PRRSV复制所必须的结构与非结构蛋白，但是PRRSV病毒毒力决定区、发病机制和保护性免疫反应的发生等方面仍没有研究的十分清楚【6，19,20J。ORF5a蛋白是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)最近鉴定出的结构蛋白【吼10J。ORF5a蛋白是动脉炎病毒发现的第8个结构蛋白。在EAV中，ORF5a基因已经在计算机分析、保守型、生物学功能等方面证实存在。ORF5a基因与ORF2b基因相似，它们的翻译都是在同一个亚基因组中利用核糖体寻找起始密码子的特点翻译两个结构蛋白【7J。在2型PRRSV中，ORF5a是为46或51个氨基酸(aa)的疏水蛋白质。最新研究表明与PRRSV同属动脉炎病毒科的马动脉炎病毒(EAv)ORF5a蛋白对病毒的感染性非常重要但非必需。我们在对ORF5密码子优化及ORF4／ORF5基因区间插入研究过程中发现破环ORF5a将造成病毒拯救失败。因此，我们推测OI讧5a蛋白对PRRSV复制必须。为了进一步验证假设，我们在1型(pSHE)和2型(pAJXM和pAPRRS)PRRSV全长感染性克隆中在不影响其它基因编码序列及亚基因组二级结构的情况下敲除ORF5a基因，结果造成病毒拯救失败。通过外源提供ORF5a蛋白的互补实验证实ORF5a敲除突变体有感染性病毒粒子产生。从而，证实ORF5a蛋白为病毒复制所必须。最后，我们在pAJXM全长感染性克隆中研究了不同长度OI心5a对PI汛SV病毒复制的影响。1材料和方法1．1质粒、抗体和细胞2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染性克隆pAPRRS(GenBank登录号：GQ330474)；1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染性克隆pSHE(GenBank登录号：GQ461593)【21'22】；2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染性克隆pAJXM根据JXMl00序列构建(GenBank登录号：GQ475526)由本实验室构建并保存。特异性识别两种基因型猪繁殖与呼吸综合征病毒N(nucleocapsid)蛋白的单克隆抗体(1AGll)由西班牙雅雷萨生物公司惠赠(IngenasaCompany，Madrid)：特异性识别2型PRRSVGP5单抗由上海兽医研究所童光志老师惠赠。二抗AlexaFluor-568羊抗鼠IgG和AlexaFluor-555羊抗兔IgG购自Invitrogen公司；(USA)。特异性识别ORF5a蛋白的抗体，(识别肽段：CARQRQQQQQLSYSVD)定制自吉尔生化上海有限公司。HPR标记的羊抗猪二抗IgG购I!tAbcam公司。非洲绿猴肾传代细胞MARC．145由本实验室保存。仓鼠肾传代细胞BHK．21 第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白对病毒感染性影响解析(CCL．10)购自美国ATCC，由本实验室保存。1．2引物合成根据GenBank上公布的JXMl00、pAPRRS、pSHE(登录号：GQ475526，GQ461593，GQ330474)，运用Primer5．0软件设计并由上海捷瑞公司合成一系列引物(表3．1)。引物用无RNA酶的去离子水溶解为100pmol／L的贮存液，使用时稀释为10pmol／L的工作液。贮存液和工作液均保存于．20。C冰箱。 猪繁殖与呼吸综合征病毒Ol诤'5a蛋白结构与功能的研究表3-1本研究用到的引物Table3-1PrimersusedinthisstudyPrimer奉Sequence(5'-3’)干purpose木引物命名说明：前缀字母F代表正向引物，R代表反向引物，J表示序列来自JXMl00(GenBank登录号：GQ475526)C表示序列来自pAPRRS(GenBank登录号：GQ461593)；S表示序列来自pAPRRS(GenBank登录号：GQ330474)：干加粗为引入的突变位点。1．3突变体全长cDNA克隆的构建1．3．1pAJXk5a突变体全长eDNA克隆的构建采用第二章中构建中间质粒pTOP．AM。经核酸序列测定后以该中间质粒为模板，引物采用表3．1中点突变引物，进行第二轮突变PCR。反应体系如下：反应成分反应体积(25．O“L)52 第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白对病毒感染性影响解析去离子水10xbufferdNTP(2．5mM)正向引物反向引物pfuUltraIIFusionHSDNA聚合酶pTOP．AM模板质粒(1：10稀释)17．0pL2．5pL2．0pL0．5pL0．5rtL0．5pL2．O止反应条件为：95℃2min95℃30s]60。C30s-20循环72℃2minj72℃10minPCR产物经电泳鉴定后，向其中加入lpLOpnI酶在37。C水浴中反应1h以消化模板质粒，后转化大肠杆菌TOPl0(转化见2．1．7)，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基，37。C培养12h。挑取疑似菌落，扩大培养后提取质粒(方法见2．1．9)经测序筛选阳性克隆，命名为pTOP-AMin3、pTOP—Amin4、pTOP-Amin5、pTOP—Amin6。以pTOP．AE进行下一步酶切反应，反应体系为：反应成分反应体积(60．0pL)去离子水36．0pL10xbuffer46．09L100xBSA0．69LAscI1．59LM／uI1．5pL质粒pTOP-AMk5a15．01aL混匀后于37℃水浴反应2h后进行凝胶电泳，纯化回收目的条带(方法同2．1．8)。同时对全长感染性克隆pAJXM进行同样双酶切，回收目的载体片段。分别将以上两次酶切回收的DNA片段按如下反应进行连接：反应成分反应体积(10．0pL)10xligasebuffer1．0pL53 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究T4DNAligase1．0“L回收片段1．0此载体片段7．O此连接反应条件为16℃水浴6小时。将连接产物转化TOPIO感受态细胞(方法见2．1．7)，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基培养，挑取疑似茵落扩大培养后提取质粒(方法见2．1．9)，，使用东盛质粒提取试剂盒提取质粒，经电泳鉴定，挑取与阳性质粒大小相同的质粒，测序进行鉴定。将测序鉴定正确的质粒分别命名为，命名为pAJXk5a，放于．20℃备用。1．3．1pAPRRSk5a和pSHEk5a突变体全长eDNA克隆的构建构建方法与pJXMk5a相似，具体方法参见实验室己发表文章【2l'2引。1．4转染和突变病毒的拯救抽提全长质粒进行，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定及SmalI酶切鉴定，方法参照实验室已发表文章[24,25]。病毒拯救后，在MARC一145细胞上连续传三代，具体方法参照第二童。1．5RT-PCR和核酸测序检测病毒基因组具体方法参照第二章。1．6间接免疫荧光分析具体方法参照第二章。1．7生长动力学和空斑形态学分析具体方法参照第二章。 第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白对病毒感染性影响解析，’娃里二：口木2．1ORF5a缺失突变病毒的拯救最新研究表明与PRRSV同属动脉炎病毒科的马动脉炎病毒(EAV)ORF5a蛋白对病毒的感染性非常重要但非必需19]。本研究中，在不影响亚基因组5二级结构情况下，ORF4／5基因区间可以插入3或者6个核苷酸而不可以插入4或者5个核苷酸。推测插入的4或者5个核苷酸破坏了ORF5a阅读框，导致病毒拯救失败。因此，我们推测PRRSVORF5a，与EAVORF5a蛋白不一样，对病毒复制是必须的。为了证实ORF5a这一假设，在l型和2型感染性克隆的基础上，我们构建了1型和2型PRRSVORF5a基因敲除突变体。pAJXM和pAPRRS为2型PRRSV全长感染性克隆，pAJXM来源于中国分离的强毒株JXl43细胞传100代后弱毒株JXMl00为骨架构建，ORF5a蛋白为46氨基酸；pAPRRS来源于2型PRRSV弱毒珠，ORF5a蛋白为51氨基酸。为了在pAJXM和pAPRRS中敲除ORF5a基因且不影响亚基因组5的二级结构，分别将ORF5a基因的起始密码子“ATG"突变为“ACG”或“GTG”构建了pAJXk5a和pAPRRSk5a。pSHE为来源于疫苗弱毒的1型PRRSV全长感染性克隆。为了在pSHE中敲除ORF5a基因且不影响亚基因组5的二级结构及ORF4的编码序列，将ORF5a基因的起始密码子“ATG"突变为“GTG”构建了pSHEk5a(图3-1．A)。我们将ORF5a敲除突变体质粒(pAJXk5a，pAPRRSk5a和pSHEk5a)和它们的母本克隆质粒直接转染BHK．21细胞进行病毒的首轮复制。在转染BHK一21细胞24小时后，将BHK-21细胞上清收集后感染新鲜的MARC．145细胞。在感染5天后，感染母本感染性克隆转染后上清的MARC．145细胞即出现典型的PRRSV细胞病变(CPE)而ORF5a敲除突变体均为有CPE产生(图3．1．B)。我们对ORF5a敲除突变体转染上清进行三代盲传仍然没有CPE出现。间接免疫荧光(IFA)结果证实，如图3．2．(A)所示，在转染BHK-21细胞24小时后，利用N蛋白的单抗检测N蛋白的表达，ORF5a缺失突变体及母本突变体均有N蛋白的表达。说明敲除突变没有影响病毒亚基因组转录及蛋白翻译。在转染后的上清感染新鲜的MARC．145细胞48小时后，利用N蛋白单抗检测ORF5a蛋白的表达。如图3．2．(B)所示，母本病毒均检测到N蛋白表达而敲除ORF5a突变体克隆均检测不到。为了进一步验证上述结果，我们做了三次平行转染BHK-21细胞实验，并且每次都进行三代盲传实验。在传代ORF5a敲除突变体样本中均观察不到CPE，并且在第三代传代上清中也检测不到病毒RNA，排除ORF5a蛋白严重影响PRRSV的感染性以至于使细胞无法产生CPE的可能(图3．3)。 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究综上所述，在1型和2型PRRSVs敲除ORF5a蛋白的实验证实ORF5a蛋白对PRRSV感染性是必须的。A)pAJXM13887pAPRRSlATGOR．F5a＼。lirpAPRRSk5a囤互二二二二二>13499pSHEB1pAJXMpAJXk5apAPRRSpAPRRSk5apSHEpSHEkSa图3．1ORF5a敲除突变病毒及亲本病毒感染后分析：A：ORF5a敲除突变病毒构建策略；B-病毒感染MARC．145细胞后分析Fig3-1infectionofwildtypeandmutantvirus：A：SchematicdiagramofORF5ainactivatedmutantsB：infectionMARC·145cellofwildtypeandmutantvirus 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白对病毒感染性影响解析A、lORF5BHl(．2lB1图3．2突变病毒及亲本病毒转染后IFA分析Fig3-2IFAofwildtypeandmutantvirusMARc．145歹歹夕／梦矿I]-actln__一一_一图3．3突变病毒及亲本病毒感染后分析Fig3-3infectionofwildtypeandmutantvirus2．20RF5a缺失突变病毒的顺式互补实验为了验证ORF5a敲除突变体pAJXk5a能否被顺式表达的ORF5a蛋白互补，57 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究pAJXM的ORF5a基因序列克隆入真核表达载体pCAGGS，构建pCAG．5a。pAJXM、pAJXk5a或者共转染pAJXk5a和pCAG．5a。转染24小时后，收集上清感染新鲜的MARC一145细胞。分别在转染BHK．21细胞24小时后及感染MARC．145细胞72小时后检测N蛋白的表达。如图3．4所示，在转染BHK一21细胞后pAJXM、pAJXk5a或者共转染pAJXk5a和pCAG．5a均可检测到N蛋白的表达。证明在ORF5a缺失突变体中亚基因组转录及结构蛋白表达正常。在转染BHK．21细胞上清感染MARC．145细胞72小时后检测N蛋白的表达，在空白对照及单独转染pAJXk5a样本中均检测不到荧光信号，说明pAJXk5a转染BHK一21细胞上清中不存在感染性病毒粒子：在pAJXM阳性对照样本中均检测到成团细胞荧光信号，说明pAJXM转染BHK．21细胞上清中存在感染性病毒粒子且可以产生二子代病毒粒子，感染相邻细胞；而在共同转染pAJXk5a和pCAG．5a样本中均检测到单个细胞的荧光信号，说明pAJXk5a转染BHK．21细胞上清中存在感染性病毒粒子但无法产生子代病毒粒子。我们将共转染的样本培养至少5天，仍然没有感染性的病毒粒子产生。我们上述结果证实，共转染实验感染性病毒粒子的产生是由于顺势表达的ORF5a蛋白，但是产生的这些病毒粒子只能完成单轮复制。互补实验说明ORF5a缺失突变体病毒拯救失败的原因是由于无法表达ORF5a蛋白而不是缺失突变对病毒基因组的影响。综上所述，ORF5a缺失突变病毒的顺势互补实验说明ORF5a蛋白对PRRSV感染性是必须的。 第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白对病毒感染性影响解析pAJXMpAJXk5apCAG一5a+图3-4通过在BHK-21细胞中表达ORF5a蛋白进行ORF5a敲除突变体互补实验Fig3-4ComplementationoftheORF5aknockoutmutantbytransientexpressionofORF5aproteininBHK．21cells2．3ORF5a延伸突变体外生长特性分析在2型PRRSV中，ORF5a蛋白存在46或51个氨基酸两种类型，我们实验室在以前的研究中发现分析ORF5a基因下游的编码序列，发现ORF5a终止密码子后潜在若干个终止密码子。以2型PRRSV全长cDNA感染性克隆pAJX25HB为骨架，突变ORF5a的终止密码子，从而延伸ORF5a蛋白。这个实验结果表明，ORF5a蛋白最多可延伸到63个氨基酸，但是延伸后的突变病毒不稳定，突变位点在测序中发现回复突变现象，暗示ORF5a蛋白仍偏好使用其原来的终止密码子终止翻译。我们在以前的研究中发现了很有意思的现象，但对突变后病毒生长特性与回复突变的关系不是十分清楚。我们以pAJXM骨架重新构建pAJX．5a(51)，pAJX．5a(63)，和pAJX．5a(91)三个ORF5a基因延伸突变体，分别将ORF5a蛋白延伸至51、63、91个氨基酸。ORF5a延伸突变体及对照质粒(pAJXM和pAJXk5a)转染MARC．145后，第六天后pAJXM、pAJX．5a(51)，59 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RFSa蛋白结构与功能的研究pAJX．5a(63)，和pAJX．5a(91)均出现CPE。收集上清感染新鲜的MARC一145细胞48d'时后，用ORF5a蛋白多抗作为一抗做间接免疫荧光实验。如图3—4．A所示，pAJXM、pAJX．5a(51)，pAJX．5a(63)，年HpAJX．5a(91)均检测到成团荧光信号，pAJXk5a未检测到信号。证明pAJX．5a(51)，pAJX。5a(63)，和pAJX．5a(91)突变病毒成功拯救。为了研究pAJX．5a(51)，pAJX．5a(63)，和pAJX一5a(91)突变病毒的体外生长特性，我们利用从MARC．145细胞上传至第三代的vAJX．5a(51)，vAJX．5a(63)，和vAJX．5a(91)病毒进行病毒生长曲线及空斑试验研究。利用不同时间点收集的病毒上清来进行TCID50测定，从而得到突变病毒的多步生长曲线。从图3．4．C中可以观察到，亲本病毒vAJXM和vAJX一5a(51)，vAJX．5a(63)和vAJX．5a(91)差异不十分显著，只是亲本病毒vAJX．5a(51)在最高点上低于亲本病毒vAJXM0．9个lg而在最初开始复制点上高于亲本病毒vAJXM1个19。说明vAJX一5a(51)生长特性上与亲本病毒存在差异。从图3-4．D可以看到，vAJX一5a(S1)空斑明显小于亲本病毒vAJXM；vAⅨ．5a(63)和vAJ)(．5a(91)两个病毒空斑存在明显的两种类型。为了研究突变病毒的遗传稳定性，挑取vAJX．5a(51)；vAJX．5a(63)和vAJX．5a(91)不同类型的空斑进行测序。发现vAJX．5a(S1)可以稳定遗传突变位点。vAJX．5a(63)和vAJX．5a(91)两株突变病毒发生了回复突变。vAJX．5a(63)中小空斑稳定遗传了突变位点；大空斑发生了OI江5a基因C139T回复突变，回复后OI心5a为46个氨基酸。vAJX．5a(91)中大空斑发生了OI强5a基NCl39T回复突变，回复后ORF5a为46个氨基酸；小空斑发生了ORF5a基因C154T回复突变，回复后ORFSa为51个氨基酸。说明在JXMl00的骨架下病毒ORF5a延伸影响了病毒的生长。我们分离到未回复突变的病毒vAJX．5a(63)，说明ORFSa蛋白延伸至63个氨基酸为ORF5a蛋白的极限。 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白对病毒感染性影响解析AjB：一】141】5E】9227E；蠕【I,Ti口岫Ⅻ：一—bTGC,．V,．T—GATGAI麟a；A嚣j《53j匝二二]巫至匠玉匠二]至卫姆j《；lj匝[二]巫j歪卫互卫C：t营T毒星‘jc，自．；。2叫CX0茸鸵)Ⅵ口￡·：爿91图3．5突变病毒的体外生长特性分析A：ORF5a基因终止密码子突变构建策略(斜体加粗表示突变)；B：ORF5a蛋白的间接免疫荧光实验；C：多步生长曲线；D：空斑形态分析Fig3-5Thebiologycharacteristicsofmutantvirusesinvitro．A：Schematicdiagramofshowingtheconstructionoffull．1engthcDNAclonesofORF5aproteinstopcodonmutants(boldanditalicsindicatemutations)．BDetectionoftheexpressionofORF5aproteinbyindirectfluorescenceassay．C：Multi-stepgrowthcurve；D：Plaquemorphologyanalysis．3讨论最近研究表明，ORF5a蛋白是PRRSV的第8个结构蛋白且在动脉炎病毒科中都存在ORF5a基因【l01。在EAV的全长感染性克隆中敲除ORF5a基因发现，病毒生长受到严重影响，说明ORF5a蛋白对EAV非必须但对病毒感染性非常重要的组成部分【9J。刘闰夏等构建的1型与2型PRRSV嵌合病毒，拯救失败的原因也从一个侧面说明ORF5a基因为PRRSV复制所必需[29]。而我们的研究结果证实，在1型(pSHE)和2型(pAJXM和pAPRRS)PRRSV全长感染性克隆中敲除ORF5a蛋白均没有感染性病毒粒子产生。通过顺势互补ORF5a蛋白可以产生单轮感染性的病毒粒子。证实 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究ORF5a蛋白是PRRSV病毒复制过程的必须成分。通过突变ORF5a基因的潜在终止密码子我们发现，ORF5a蛋白对PRRSV生长的影响。为了更好的研制新的PRRSV标记疫苗，我们在不影响sgmRNA5结构的情况下，ORF4／ORF5区间插入3～6个碱基。通过转染BHK．21细胞进行病毒拯救，发现插入3或6个碱基病毒可以拯救而4或5个碱基不能被拯救，值得分析的是，结合本次实验结果在RF4／ORF510bp间隔序列之间或之后，即ORF5的起始密码子之前只允许3、6、12、18个核苷酸的插入。这涉及PRRSV病毒复杂的转录和翻译过程。对于转录过程，我们没有影响到TRS序列，虽然我们改动了TRS周围的序列，有可能影响TRS周围序列的一级结构和二级结构在转录中发挥着作用。但是我们的实验结果证实亚基因组5及其下游基因组的转录并未受到影响。亚基因组5的TRS序列也没有受到影响。对病毒翻译过程分析结果看，GP5及下游N蛋白表达没有受到明显影响。从我们插入及报道的插入序列上看，插入序列均为密码子的倍数。我们推测我们的插入因为破坏了ORF5a基因而造成病毒拯救失败。接下来我们设计实验说明在l型(pSHE)和2型(pAJXM和pAPRRS)PRRSV全长感染性克隆中敲除ORF5a蛋白均没有感染性病毒粒子产生。通过顺势互补ORF5a蛋白可以产生单轮感染性的病毒粒子。证实ORF5a蛋白是PRRSV病毒复制过程的必须成分。但这个结果与在EAV中的研究结果不同。以前的研究结果说明，EAV的所有结构蛋白对于病毒的基因组复制及亚基因组的转录是非必须的【26】。我们的研究结果与这个结论相符合，ORF5a敲除突变体在转染BHK．21细胞后均检测到亚基因组的转录及结构蛋白的表达。暗示新发现的ORF5a蛋白在病毒基因组复制及亚基因组转录中不起关键作用。与在EAV中的研究结果类似，ORF5a蛋白敲除突变体可以通过顺势表达ORF5a蛋白的互补。这些结果暗示ORF5a蛋白与PRRSV其它结构蛋白一样在病毒基因组复制及亚基因组转录中不起关键作用而在病毒感染性中起重要作用。从目前的研究结论上仍无法确定ORF5a蛋白在病毒复制过程中的功能。ORF5a蛋白已经在高度纯化的病毒粒子中通过光谱坚定的方法证实其包装在病毒囊膜上，并且可刺激猪产生特异抗体【101。动脉炎病毒ORF5a蛋白有着类似的功能区，在ORF5a蛋白的N端存在保守的MF序列、疏水跨膜区和R／Q膜内区。但是现在还没有实验证实这些区域在病毒复制过程中所起的作用。在EAV和PRRSV中敲除ORF5a蛋白对病毒感染性造成的不同结果，暗示ORF5a蛋自在这两种病毒复制过程中所起的作用存在差异。2型PRRSV中ORF5a蛋白的C端可变性是由于发生了ORF5a基因C139T的点突变，产生了新的终止密码子，使有些PRRSV毒株ORF5a蛋白缺失5个氨基酸【lU，27J。在中国分离的强毒株在传代过程中发生了ORF5a基因12个核苷酸的插入【28|，从现在的结果上看，这个插入在ORF5a蛋白中插入了4个氨基酸。这些结果说明，ORF5a62 第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白对病毒感染性影响解析蛋白的N、C端在ORF5a蛋白发挥作用过程中可能不起主要作用，整个ORF5a蛋白的长度是可变的。我们的实验结果，vmJX．5a(51)在ORF5a基因141位的终止密码子灭活从而ORF5a蛋白延伸至51个氨基酸，虽然vAJX．5a(51)生长特性受到影响且空斑明显变小但病毒仍可拯救，说明在JXMl00的骨架下病毒ORF5a延伸影响了病毒的生长。暗示ORF5a蛋白在病毒粒子中起重要作用。vAJX．5a(63)带有ORF5a基因141位、156位的终止密码子灭活从而ORF5a蛋白延伸至63个氨基酸，虽然其子代病毒发生回复突变，但我们分离到未回复突变的病毒，暗示ORF5a蛋白延伸至63个氨基酸为其极限，过度延伸可能会造成ORF5a蛋白无法包装入病毒粒子。 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究参考文献[1】1CollinsJE，BenfieldDA，ChristiansonWT，eta1．Isolationofswineinfertilityandrespiratorysyndromevirus(isolateATCCVR-2332)inNorthAmericaandexperimentalreproductionofthediseaseingnotobioticpigs[J]．JVetDiagnInvest，1992，4(2)：117．126．【2】PatonDJ，BrownIH，EdwardsS，eta1．’Blueeartdiseaseofpigs[J]．VetRec，1991，128(26)：617．【3]3WensvoortGTerpstraC，PolJM，eta1．MysteryswinediseaseinTheNetherlands：theisolationofLelystadvirus[J]．VetQ，1991，13(3)：121．130．【4】ZhouL，YangH．PorcinereproductiveandrespiratorysyndromeinChina[J]．VirusRes，2010，154(1-2)：31-37．[5]NeumannEJ，KliebensteinJB，JohnsonCD，eta1．AssessmentoftheeconomicimpactofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeonswineproductionintheUnitedStates[J]．JAmVetMedAssoc，2005，227(3)：385．392．[6】6SnijderEJ，MeulenbergJJ．Themolecularbiologyofarteriviruses[J]．JGenVirol，1998，79(Pt5)(961-979．[7】7SnijderEJ，VanTolH，PedersenKW,eta1．Identificationofanovelstructuralproteinofarteriviruses[J]．JVirol，1999，73(8)：6335．6345．【8】WuWH，FangYFarwellReta1．A10-kDastructuralproteinofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusencodedbyORF2b[J]．Virology,2001，287(1)：183-191．[9】FirthAE，Zevenhoven-DobbeJC，WillsNM，eta1．DiscoveryofasmallartefivirusgenethatoverlapstheGP5codingsequenceandisimportantforvirusproduction[J]．JGenVirol，2011，92(Pt5)：1097-1106．[10]JolmsonCR，GriggsTF,GnanandarajahJ，eta1．NovelstructuralproteininporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusencodedbyanalternativeORF5presentinallartefiviruses[J]．JGenVirol，2011，92(Pt5)：1107-116．【11]PastemakAO，SpaanWJ，SnijderEJ．Nidovirustranscription：howtomakesense⋯?【J】．JGenVirol，2006，87(Pt6)：1403—1421．[12】SawickiSG,SawickiDL，SiddellSt2Acontemporaryviewofcoronavirustranscription[J]．JVirol，2007，81(1)：20-29．[13]FaabergKS，PlagemannPGTheenvelopeproteinsoflactatedehydrogenase—elevatingvirusandtheirmembranetopography[J]．Virology,1995，212(2)：512-525． 第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白对病毒感染性影响解析[14]SnijderEJ，DobbeJC，SpaanWJ．Heterodimerizationofthetwomajorenvelopeproteinsisessentialforarterivirusinfectivity[J]．JV'trol，2003，77(1)：97—104．【15]WieringaRDeVriesAA，RottierPJ．Formationofdisulfide．1inkedcomplexesbetweenthethreeminorenvelopeglycoproteins(GP2b，GP3，andGP4)ofequinearteritisvirus[J]．JVh'ol，2003，77(11)：6216-6226．[16]WissinkEH，K．roeseMV，Van州kHA，eta1．Envelopeproteinrequirementsfortheassemblyofinfectiousvirionsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J]．JVirol，2005，79(19)：12495-12506．[17]TianD，WeiZ，Zevenhoven—DobbeJC，eta1．Arterivirusminorenvelopeproteinsareamajordeterminantofviraltropismincellculture[J]．JVirol，2012，86(7)：3701—3712．【18]RowlandRR,KervinRKuckleburgC，eta1．ThelocalizationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnucleocapsidproteintOthenucleolusofinfectedcellsandidentificationofapotentialnucleolarlocalizationsignalsequence[J]．VirusRes，1999，64(1)：1-12．[19]DoklandT．ThestructuralbiologyofPRRSV[J]．VirusRes，2010，154(1—2)：86．97．[20]WangYLiangYHanJ，eta1．AttenuationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusstrainMNl84usingchimericconstructionwithvaccinesequence[J]．Virology,2008，371(2)：418-429．[21]TianD，ZhengH，ZhangReta1．Chimericporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusesrevealfullfunctionofgenotype1envelopeproteinsinthebackboneofgenotype2叨．Virology,2011，412(1)：1-8．[22]YuanS，WeiZ．ConstructionofinfectiouscDNAclonesofPRRSV：separationofcodingregionsfornonstructuralandstructuralproteins[J]．SciChinaCLifeSci，2008，5l(3)：271—279．[23]ZhangR，ChenC，SunZ，eta1．Disulfidelinkagesmediatingnucleocapsidproteindimerizationalenotrequiredforporcineartefivirusinfectivity[J]．JVirol，2012，86(8)：4670．4681．【24]LvJ，ZhangJ，SunZ，eta1．AninfectiouseDNAcloneofahighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusvariantassociatedwithporcinehighfeversyndrome[J]．JGenVirol，2008，89(Pt9)：2075．2079．【25]LuJ，GaoF，WeiZ，eta1．A5'-proximalstem—loopstructureof5’untranslatedregionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusgenomeiskeyforvirusreplication[J]．VirolJ，2011，8(172．65 猪繁殖与呼吸综合征病毒OEF5a蛋白结构与功能的研究【26]MolenkampR，VanTolH，RozierBC，eta1．ThearterivimsreplicaseistheonlyviralproteinrequiredforgenomereplicationandsubgenomicmRNAtranscription[J]．JGenⅥrol，2000，81(Pt10)：2491-2496．[27]JohnsonEM．”I'vegotyourback”．Newevidenceshowsthatchimpanzeesaren’tasselfishasmanyscientiststhought[J]．SciAm，2011，305(4)：22．[28]HanW，WuJJ，DengXYeta1．Molecularmutationsassociated沥ththeinvitropassageofvirulentporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J]．VirusGenes，2009，38(2)：276—284．【29]刘闰夏，蔺涛，田德斌，等．猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a／ORF5重叠区的分离[J】．中国动物传染病学报，2012，20(2)：29．35 第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白对病毒感染性影响解析Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)ORF5aproteinisrequiredforvirusinfectivityAbstract：TheORF5aprotein，anewlyidentifiedviralproteininvirusparticleofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)，isahydrophobicproteinwith46or51aminoacids(aa)．Thehomologous5aproteinofEquineArteritisVirus(EAV)，anothermemberofthefamilyArteriviridae，isimportantforvirusinfection，butnotessential．Initially，wefoundthatORF4／ORF5caninsert3or6nt，howeverCall’tinsert4or5nt．WehypothesizedthatORF5aproteinisrequiredforvirusinfectivity．Furthermore，inactivationofORF5aexpressioninbothtype1andtype2PRRSVbyreversegeneticscouldn’tyieldviablePRRSV，andvirusproductioncouldbecomplementedbyCO-transfectionofORF5aproteinexpressionplasmid．However，ORF5aproteincouldbeextendedto91aminoacidsbyinactivationofthestopcodoncandidatesbyreversegenetics．Takentogether，inthisstudy，ORF5aproteinwasdemonstratedtobeessentialforvirusinfectivityinbothtype1andtype2PRRSV，anditsCterminalcouldbevariable．Keywords：PRRSV；ORF5a；viability67 第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究摘要：通过对比目前在临床中分离的PRRSV基因组序列中ORF5a序列，发现在2型PRRSV中ORF5a蛋白29和30位存在保守的半胱氨酸。为研究ORF5a蛋白保守半胱氨酸在病毒复制过程中的作用。我们将感染性克隆pAJXM中半胱氨酸突全部或部分突变为丝氨酸(serine)，构建全长感染性克隆pAJXMSl、pAJXMS2、pAJXMSS。将突变克隆均能在转染BHK-21细胞均拯救出了突变病毒。说明ORF5a蛋白的保守半胱氨酸对病毒复制是非必需的，但pAJXMS2和pAJXMSS第30位突变为丝氨酸突变体病毒生长特性受到严重影响。接着，将pAJXM中半胱氨酸突全部或部分突变为甘氨酸(glycine)，构建全长感染性克隆pAJXMGl、pAJXMG2、pAJXMGG。pAJXMG2和pAJXMGG第30位突变为甘氨酸时无法拯救出病毒。随后，采用双分子互补荧光实验分析发现，ORF5a蛋白第30住突变为甘氨酸时影响ORF5a蛋白同源二聚体形成。体外实验分析ORF5a蛋白发现ORF5a蛋白同源二聚体通过非共价键形式形成。上述研究结果说明ORF5a蛋白的保守半胱氨酸对病毒复制是非必需，而ORF5a蛋白非共价键同源二聚体对PRRSV复制过程是必须的；ORF5a蛋白的第30位半胱氨酸为该蛋白的关键位点。关键词：PRRSV；ORF5a；半胱氨酸突变；同源二聚体PRRSV感染猪引起的猪蓝耳病给世界养猪业带来了巨大经济损失，现已成为危害规模化养猪生产的主要疫病之一【11。1996年国际病毒学分类委员会(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV)将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)，连同马动脉炎病毒(Equinearteritisvirus，EAV)、猴出血热病毒(Simianhaemorrhagicfevervires，SHFV)、鼠乳酸脱氢酶病毒(Lactatedehydrogenaseelevatingvirus，LDV)一起被归到一个新建立的动脉炎病毒科中【2’3】。动脉炎病毒科与冠状病毒科(Coronaviridae)、罗尼病毒科(Roniviridae)一起归于套式病毒目(Nidovirales)。动脉炎病毒科病毒感染动物之后，69 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究引起从无临床症状的持续性感染到致死性的急性感染不等的症状【4j。PRRSV基因组的结构从5’端的非编码区(5’terminaluntranslatedregion)开始有10个开放阅读框。非结构蛋白编码区占基因组长度～75％(ORFla、ORFlab)[5-7]最近研究揭示在非结构蛋白编码区存在一个新的编码框nsp2TFI引。这些非结构蛋白主要介导基因组复制和亚基因组转录16】。结构蛋白编码区域(ORFs2a，2b，ORF3，ORF4，ORFs5a，5b，ORF6和ORF7)编码GP2a、2b、GP3、GP4、ORF5a蛋白、GP5、M、N蛋白【9，10l。GP2a、GP3、GP4和GP5为定位于病毒囊膜的糖基化蛋白；M、2b、ORF5a蛋白为病毒囊膜上非糖基化蛋白。这些结构蛋白对于病毒复制均为必须的【¨J。在前面的实验证明ORF5a蛋白虽然在两型PRRSV中证实对病毒复制是必须的，但目前还不知其具体功能【12|。通过对比目前在临床中分离的PRRSV基因组序列中ORF5a序列，发现在2型PRRSV中ORF5a蛋t兰129和30位存在保守的半胱氨酸。以前研究表明，病毒结构蛋白之间共价键形式的相互作用可以提高病毒例子的稳定性【13‘17】。在有囊膜的病毒中，与核衣壳蛋白或M蛋白相互作用的蛋白有助于病毒粒子的包装【l81。以前研究表明，PRRSV中GP5与M蛋白之间共价键相互作用为病毒复制所必须；N蛋白之间共价键虽然对于病毒复制非必须但是突变半胱氨酸位点后严重影响病毒的复制【l9I。为了研究2型PRRSV中ORF5a蛋11t29和30位存在保守的半胱氨酸，利用2型PRRSV感染性克隆载体pAJXM研究了ORF5a蛋白保守型半胱氨酸在病毒复制过程中的作用。我们在本章中研究发现ORF5a蛋白的保守半胱氨酸对病毒复制是非必需的而ORF5a蛋白非共价键同源二聚体对PRRSV复制过程是必须的。1材料与方法1．1质粒、抗体和细胞2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染性克隆pAJXM根据JXMl00序列构建(GenBank登录号：GQ475526)由本实验室构建并保存。特异性识别两种基因型猪繁殖与呼吸综合征病毒N(nucleocapsid)蛋白的单克隆抗体(1AGll)由西班牙雅雷萨生物公司惠赠(IngenasaCompany，Madrid)；二抗AlexaFluor-568羊抗glgG和AlexaFluor-555羊抗兔IgG购自Invitrogen公司；(USA)。特异性识别0I讧5a蛋白的抗体，(识别肽段：CARQRQQQQQLSYSVD)定制Abmart生物有限公司。HPR标记的羊抗猪二抗IgG购!刍Abeam公司。非洲绿猴肾传代细胞MARC一145由本实验室保存。仓鼠肾传代细胞BHK一21 第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究(CCL．10)购白美国ATCC，由本实验室保存。1．2引物合成根据GenBank上公布的JXMl00(登录号：GQ475526)，运用Primer5．0软件设计并由上海捷瑞公司合成一系列引物(表4．1)。引物用无RNA酶的去离子水溶解为100pmol／L的贮存液，使用时稀释为10pmol／L的工作液。贮存液和工作液均保存于·20℃冰箱。 猪繁殖与呼吸综合征病毒01疆Sa蛋白结构与功能的研究表4-1本研究用到的引物Table4—1Primersusedinthisstudy木引物命名说明：前缀字母F代表正向引物，R代表反向引物，J表示序列来自JXMl00(GenBank登录号：GQ475526)t小写字母为引入的突变位点。1．3突变体全长cDNA克隆的构建采用第二章中构建中间质粒pTOP-AM。经核酸序列测定后以该中间质粒为模板，引物采用表4．1中点突变引物，进行第二轮突变PCR。反应体系如下：反应成分反应体积(25．09L)去离子水17．09L10×buffer2．59L 第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究dNTP(2．5mM)正向引物反向引物pfuUltraIIFusionHSDNA聚合酶pTOP—AM模板质粒(1：10稀释)2．09L0．59L0．5}-tLO．59L2．09L反应条件为：95℃2min95℃30s]60℃30sL20循环72℃2minj72℃10minPCR产物经电泳鉴定后，向其中加入l此DpnI酶在37。C水浴中反应1h以消化模板质粒，后转化大肠杆菌TOPl0(转化见2．1．7)，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基，37。C培养12h。挑取疑似菌落，扩大培养后提取质粒(方法见2．1．9)经测序筛选阳性克隆，命名为pTOP-。以pTOP-AM5aGl、pTOP—AM5aG2、pTOP—AM5aGG、pTOP．AM5aSl、pTOP．AM5aS2、pTOP-AM5aSS进行下一步酶切反应，反应体系为：反应成分反应体积(60．0p．L)去离子水36．O“L10xbuffer46．0I_tL100xBSA0．69LAscI1．59LM／uI1．5pL质粒pTOP-AM5aGl15．09L混匀后于37。C水浴反应2h后进行凝胶电泳，纯化回收目的条带(方法同2．1．8)。同时对全长感染性克隆pAJXM进行同样双酶切，回收目的载体片段。分别将以上两次酶切回收的DNA片段按如下反应进行连接：反应成分反应体积(10．09L)10xligasebuffer1．0laLT4DNAligase1．0I，tL回收片段1．09L73 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究载体片段7．0pL连接反应条件为16℃水浴6小时。将连接产物转化TOPl0感受态细胞(方法见2．1．7)，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基培养，挑取疑似茵落扩大培养后提取质粒(方法见2．1．9)，，使用东盛质粒提取试剂盒提取质粒，经电泳鉴定，挑取与阳性质粒大小相同的质粒，测序进行鉴定。将测序鉴定正确的质粒分别命名为，命名为pAJX5aGl、pAJX5aG2、pAJX5aGG、pAJX5aS1、pAJ-X5aS2、pAJ-X5aSS，放于-20。C备用。1．4转染和突变病毒的拯救抽提全长质粒进行，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定及SmalI酶切鉴定，方法参照实验室己发表文章D0,21]。病毒拯救后，在MARC一145细胞上连续传三代，具体方法参照第二童。1．5RT-PCR和核酸测序检测病毒基因组具体方法参照第二章。1．6间接免疫荧光分析具体方法参照第二章。1．7生长动力学和空斑形态学分析具体方法参照第二章。1．8蛋白杂交实验1．8．1主要试剂的配制0．5mol／LTris(PH6。81：称量6．0559Tris．base，加入约80ml去离子水，充分搅拌溶解，用浓盐酸调节pH值至6．8左右，最后定容至100ml。1．5moULTris(PH8．8)：74 第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究称量18．179Tris．base，加入约80ml去离子水，充分搅拌溶解，用浓盐酸调节pH值至8．8，最后定容至lOOml。10％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液：称取1009电泳级SDS加入约900ml去离子水，加热助溶，最后加水定容至1L。10％过硫酸铵：在1．5ml离心管中称量约O．1g过硫酸铵，根据过硫酸铵质量加入去离子水后混匀溶解。储存于4℃。30％丙稀酰胺：称量丙烯酰胺(Acrylamide)299，双丙烯酰胺(BIS)lg，加入约60ml去离子水，充分搅拌溶解。于棕色瓶中4℃保存。5×SDS．PAGE电泳缓冲液：称量Tfis．base15．1g，Glycine94g，10％SDS50ml，加入约900ml去离子水混匀溶解，定容至1L，室温保存。5×SDS凝胶加样缓冲液：量取0．5mol／LTfis(pn6．8)1．2ml，10％甘油lml，10％SDS2ml，B-巯基乙醇0．5ml，溴酚蓝0．019充分溶解后定溶至lOml，保存于-20。C。染色液：在450ml甲醇和50ml的冰醋酸的混合液中溶解1．259考马斯亮蓝R250，过滤后储存于常温。脱色液：取乙酸300ml、甲醇lOOml混匀，加水定容1L，储存于室温。1．8．2SDS．PAGE蛋白电泳(1)铝lj样：蛋白样品充分裂解后在100。C将样品煮沸10rain，12000r／min离心5min，取出上清，保存于．20℃或直接进行SDS—PAGE蛋白电泳。(2)flilJ胶：按照GE垂直电泳仪说明书配制12．5％的分离胶，加入玻璃板间，并在胶上加入一些去离子水压平。在分离胶凝固后，倒掉上层的水，加入按GE垂直电泳仪说明书配制的5％的浓缩胶，并将样品梳插入浓缩胶中。(3)上样：待浓缩胶凝固后，拔出样品梳，用蒸馏水将加样孔充分洗干净，然后加满电泳液，加样(20“LI孔)。(4)电泳：开始电压为90V,25mA，当染料进入分离胶后，将电压调至220V，25mA直至溴酚蓝具板底lcm时，停止电泳。 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究1．8．3蛋白杂交实验转膜：(1)切胶：以Marker为对照进行切胶。(2)备膜：裁剪与胶的大小相当硝酸纤维素膜和滤纸。将切好的硝酸纤维素膜置于放入转膜缓冲液中平衡15min。(3)装膜：将转膜用的夹子打开使黑的一面(负极)保持水平。在垫子上垫上浸泡好的滤纸，随后按照凝胶一硝酸纤维素膜一滤纸一海绵垫的顺序依次叠放。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。(4)转膜：使用80mA转膜2h。免疫反应：(1)封闭：将膜用TBST中漂洗3次，每次5min。漂洗后将硝酸纤维素膜放入加有5％脱脂奶粉封闭液的平皿中，侧摆摇床室温低速孵育2h。(2)一抗孵育：将膜用TBST中漂洗3次，每次5min。洗完后将TBST尽可能沥干，放入加有一抗(一抗按1：1000稀释)的平皿中侧摆摇床室温低速孵育2h。(3)--抗孵育：将膜用TBST中漂洗3次，每次10min。然后将硝酸纤维素膜放入加有二抗(二抗按1：2000稀释)的平皿中，避光室温孵育2h。孵育后将硝酸纤维素膜在TBST中洗3次每次lOmin。化学发光，显影，定影：(1)在暗室中将A和B两种试剂在小离心管里按照发光试剂盒说明书操作将其混合在平整盖上保鲜膜，硝酸纤维素膜蛋白面向下放在保鲜膜，约lmin后，去尽残液，放入X光片夹中。(3)剪相同大小的X—Ray感光胶片，置硝酸纤维素膜上，作好标记。根据信号的强弱适当调整曝光时间lmin。(4)曝光完成后，迅速浸入显影液中显1min(20---,25。C)，显影结束后，X一光片在超纯水中洗涤lmin，然后再放入定影液中，定影时间一般为lmin，以胶片透明为止，最后在超纯水中洗涤lmin，取出室温下晾干。1．9双分子互补荧光实验(BiFC)根据文献报道的方法‘22,231，我们采用点突变的方法在质粒pVeneus的基础上，拆分为pVN(包含Veneus蛋白N端173个氨基酸)和pVC(包含Veneus蛋白N端后76 第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究173个氨基酸)两个部分。待检测的两个目的蛋白通过连接序YtJ(GGGGS)3[24,251分别与pVN和pVC融合表达。双分子互补荧光实验(BiFC)实验方法采用实验室已发表文章方法【19】。6孔板中MARC．145长满平板约60％时共转染500ngBiFC质粒。在转染16小时后在荧光显微镜下观察。2结果2．1ORF5a蛋白序列分析我们收集目前NCBI上全部274个2型PRRSV基因组ORF5a序列，并进行序列对比和结构预测，以分析潜在结构与功能基序。如图4．1所示，字母的高度表示该处氨基酸的保守性，字母的颜色表示氨基酸的性质。其中蓝色表疏水氨基酸(Y，V，M，C，L，F，I和W)，绿色表示中性(S，G，H，T，A和P)，黑色表示亲水性(R，K，D，E，N和Q)。ORF5a蛋白尽管在几处氨基酸有突变，但是这些氨基酸在亲水性上相同，保证了2型PRRSV．中ORF5a蛋白具有类似的结构功能区域。ORF5a蛋白有一个疏水区(5．30位氨基酸，图4．1框中所示)。这个疏水片段经预测可以完成一次跨膜。ORF5a蛋白两端存在保守的疏水氨基酸。从氨基酸序列上看，在29和30位存在保守的半胱氨酸；C端预测的膜内区有一个保守的R／Q基序。1釜暑盏o2△0Il-lGIIM-lI踟高ll『IlfIlJIsⅢ噩陛lHlIlS，i，t赢't-虫4b如图4．1NCBI中所有ORF5a序列对比Fig4-1AlignmentofalltheORF5asequencesofPRRSVisolatesinNCBI2．2全长cDNA克隆构建以中间质粒pTOP．AM构建中间质粒突变体pTOP．AM5aGl、pTOP．AM5aG2、pTOP-AM5aGG、pTOP-AM5aSl、pTOP-AM5aS2、pTOP．AM5aSS。测序鉴定，表明77 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究中间质粒构建成功，并且涉及到构建操作的序列与模板相比没有突变，相似性为100％。以上结果表明成功获得了与预期设计相符的中间质粒。利用pAJXM和中间质粒上带有的AscI、MluI酶切位点，用AscI、Mlu1分别对pAJXM和中间质粒进行双酶切。回收目的片段后将杂和片段连接到pAJXM骨架，构建嵌合全长cDNA克隆。使用相应引物对构建的全长cDNA克隆的插入基因部分进行序列测定，结果表明全长嵌合克隆构建成功，命名为pAJX5aGl、pAJX5aG2、pAJX5aGG、pAJX5aS1、pAJX5aS2、pAJX5aSS，全长克隆结构如图4．2所示。pAJXM『———贫——＼-pAJX一5aGlIMGC＼pAJX-5aG2『———丽——＼．pAJX-5aGG『———丽——＼I2．3病毒拯救结果图4-2ORF5a蛋白半胱氨酸突变体构建方法示意图Fig4-2SchematicdiagramofORF5aprotein将构建好的半胱氨酸突变全长cDNA克隆及阳性对照pAJXM转化大肠杆菌后，使用QIAprepSpinMiniprepKit高纯度质粒提取试剂盒抽提质粒，并溶解于无RNA酶的超纯水中。将提取的质粒经紫外分光光度计测定浓度后，转染新鲜的BHK．21细胞。在转染后24小时，收取上清并感染新鲜的铺满单层的MARC．145细胞。在5天左右，pAJX5aGl、pAJX5aSl、pAJX5aS2、pAJX5aSS在样品孔出现了比较明显的细胞病变(CPE)，表现为细胞皱缩凝集成团，并逐步脱落，与阳性对照pAJXM孔相似。pAJX5aG2、pAJX5aGG及空白对照上清液连续盲传3代，均无可见CPE产生。对拯7812S铅觅钿聪ⅨAp 第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究救出的子代病毒分别进行基因水平和蛋白水平上的鉴定。在转染BHK．21细胞24小时及感染MARC．145细胞48小时后，用特异性识别PRRSVN蛋白的抗体对细胞进行IFA检测。结果如图4．3所示，pAJX5aGl、pAJX5aG2、pAJX5aGG、pAJX5aSl、pAJX5aS2、pAJX5aSS及阳性对照pAJXM转染的细胞能被PRRSV的N蛋白特异性抗体染色，说明构建的突变体没有影响病毒亚基因组转录及翻译。在感染MARC．145细胞48小时后，用特异性识别PRRSVN蛋白的抗体对细胞进行IFA检测。pAJX5aGl、pAJX5aSl、pAJX5aS2、pAJX5aSS和pAJXM均有成团细胞染色；pAJX5aG2和pAJX5aGG观察不到荧光信号。以上结果表明：半胱氨酸突变全长cDNA克隆pAJX5aGl、pAJX5aSl、pAJX5aS2、pAJX5aSS拯救出了子病毒，pAJX5aG2和pAJX5aGG则没有拯救出病毒。综上所述，两处半胱氨酸均可被突变为丝氨酸说明ORF5a蛋白半胱氨酸对于病毒复制非必需；第30位的半胱氨酸可以突变为丝氨酸而突变为甘氨酸拯救病毒失败，说明该突变可能影响了蛋白的二级结构而影响ORF5a的功能。pAJXMpAJX··5aGlpAJX·-5aG2pAJX·-5aGGpAJX··5aSlpAJX·-5aS2pAJX-·5aSS图4．3嵌合病毒及亲本病毒感染MARC．145后IFA分析Fig4-3IFAofvAPRRSandvAPRRS(EAV4、onMARC-1452．4ORF5a蛋白半胱氨酸突变病毒的生物学特性为了初步研究ORF5a蛋白半胱氨酸突变病毒的生物学特征，对突变病毒vAJX5aGl、vAJX5aSl、vAJX5aS2、vAJX5aSS在MARC．145细胞上的生长动力学特 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究征和空斑形态学进行分析。为了研究这些嵌合病毒在体外的生长特性，选取拯救的突变病毒vAJX5aGI、vAJX5aSl、vAJX5aS2、vAJX5aSS和亲本毒vAJXM第三代病毒来绘制其多步生长曲线。0．01MOI的P3代病毒感染新鲜的MARC．145细胞，分别在规定的时间点收取病毒上清，进行TCID50试验测定各个时间点的病毒滴度，制作其多步生长曲线，如图4．4．(A)所示，突变29位半胱氨酸vAJX5aGl和vAJX5aSl与亲本病毒在MARC．145上具有相似的增殖能力；突变30位半胱氨酸vAJX5aS2和vAJX5aSS与亲本病毒在MARC．145的增殖能力低大约10倍。将突变病毒在MARC．145细胞上连续传至P3代，以适当稀释度的病毒液感染细胞之后，用含低熔点琼脂的营养培养基培养4天。形成的空斑经过甲醛固定、结晶紫染色后观察形态。突变合病毒与亲本病毒的空斑形态如图4-4．(B)所示。突变29位半胱氨酸vAJX5aGl和vAJX5aSl与亲本病毒在MARC．145上具有相似的空斑形态；突变30位半胱氨酸vAJX5aS2和vAJX5aSS与亲本病毒相比在MARC．145上的空斑形态明显较小。暗示ORF5a蛋白30位半胱氨酸在病毒复制过程中起重要作用。 第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究§苎要l；●ll斗■肆一n■蕾斜，■H●Ln●帐蛔■d岫^图4．4亲本病毒以及突变病毒生长特性和病毒的空斑形态学比较Fig4-4Multi—stepgrowthcalveandplaquemorphologyanalysisofthemutantandparentalvieuses2．5ORF5a蛋白体外分析最近研究表明，在肺泡巨噬细胞(PAM)中表达ORF5a蛋白发现ORF5a蛋白之间存在以非共价键形式形成的同源二聚体【26】。为了进一步研究ORF5a蛋白同源二聚体，我们采用了最近建立的双分子互补荧光实验(BiFC)。BiFC实验可以在可视条件下定位研究蛋白之间相互作用【19]。我们把pAJXM及半胱氨酸突变体质粒中ORF5a序列克隆如本实验构建的BiFC质粒VN和VC构建5a-VN／5a-VC，5aGl．VN／J5aGl．VC，J5aG2一VN／J5aG2．VC，J5aSl．VN／J5asl．VC，J5aS2-VN／J5aS2一VC，J5aGG．VN／J5aGG．VC，J5aSS．VN／J5aSS．VC。在新鲜的MARC．145细胞中，转染以上质粒对。如图4．5所示，在转染16小时后，转染质粒对5a-VN／5a-VC，J5aGl一VN／J5aGl．VC，J5aSl．VN／J5aSl．VC，J5aS2．VN／J5aS2．VC，J5aSS．VN／J5aSS-VC的样本中观察到荧光信号；转染质粒对J5aGG．VN／J5aGG—VC和J5aG2-VN／J5aG2-VC没有观察到荧光信号。BiFC结果表明ORF5a蛋白之间在MARC．145存在相互作用，但是ORF5a蛋白中Cys30突变为甘氨酸时影响了ORF5a蛋白之间的相互作用。这也解释了为什么ORF5a蛋白中Cys30突变为甘氨酸影响病毒的感染性。81 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究图4．5ORF5a蛋白及其半胱氨酸突变体双分子互补荧光实验(BiFC)分析Fig4—5Bimolecularfluorescencecomplementation(BiFC)analysisofORF5a．2．6ORF5a蛋白体外分析最近研究表明，在肺泡巨噬细胞(P枷)中表达ORF5a蛋白发现ORF5a蛋白之间存在以非共价键形式形成的同源二聚体【261。但是ORF5a蛋白在MARC．145细胞中同源二聚体之间相互作用方式未知。为了研究ORF5a蛋白之间在MARC．145细胞中是否会形成共价键。我们在新鲜的MARC．145细胞中转染ORF5a蛋白的真核表达载体pCAG．5a。在转染24小时后，裂解细胞后在还原和非还原条件下进行SDS．PAGE。蛋白杂交试验结果如图4-6所示，在还原和非还原条件ORF5a蛋白均为大约9kd的单聚体。从以上结果上看，ORF5a蛋白在MARC．145细胞中同源二聚体以非共价键形式形成。 第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究3讨论2+DTTanti—ORF5a．．9kd图4．6PRRSV感染MARC．145细胞后ORF5a蛋白分析Fig4-6theabsenceofORF5aproteindimedzationinPRRSV-infectedcells在本章研究中发现，通过对比目前在临床中分离的PRRSV基因组序列中ORF5a序列，发现在2型PRRSV中ORF5a蛋白29和30位存在保守的半胱氨酸。利用2型PRRSV感染性克隆载体pAJXM研究了ORF5a蛋白保守型半胱氨酸在病毒复制过程中的作用。将pAJXM中半胱氨酸突全部或部分突变为丝氨酸(serine)均拯救出了突变病毒。说明ORF5a蛋白的保守半胱氨酸对病毒复制是非必需的。将pAJXM中半胱氨酸突全部或部分突变为甘氨酸(glycine)时，第30位突变为甘氨酸时无法拯救出病毒。利用双分子互补荧光实验分析发现，ORF5a蛋白第30位突变为甘氨酸时影响ORF5a蛋白同源二聚体形成。体外分析ORF5a蛋白发现ORF5a蛋白同源二聚体通过非共价键形式形成。综上所述，ORF5a蛋白的保守半胱氨酸对病毒复制是非必需的而OI江5a蛋白非共价键同源二聚体对PRRSV复制过程是必须的。在进行这项研究的同时，国外同行在PAM细胞中对ORF5a蛋白体外研究结果证实，在肺泡巨噬细胞(PAM)中表达ORF5a蛋白发现ORF5a蛋白之间存在以非共价键形式形成的同源二聚体【261。这一结果从另一方面证实了我们的结论。如图4．7所示，SOSUI预测PRRSVVR2332的ORF5a蛋白为I型跨膜蛋白，包 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究含一个Q螺旋和一个跨膜区【z7‘29|，包括N端的膜外区(5．12aa)、C端的膜内区(13．31aa)和中间Q螺旋疏水跨膜区。ORF5a蛋白的29位和30位是半胱氨酸，位于跨膜区的内部边缘。它们可能形成二硫键，但在PAM细胞中表达ORF5a蛋白发现这两个半胱氨酸没有形成二硫键【26，30,3¨。ORF5a蛋白C端有一个高度保守的富含谷氨酰胺和精氨酸的RQ基序，蛋白序列同源对比、区域对比及二级结构元件分析并没有将其归于已知蛋白家族中【321，因为其富含碱性氨基酸推测其参与RNA结合、调节mRNA的剪接、转运与包装【33，34J。PRRSVORF5a蛋白C端存在5个氨基酸的差异，QLDAM的存在与否导致PRRSVORF5a蛋白长度不等，即2型PRRSV的ORF5a蛋白包含46个或51个氨基酸。Han等将JXA．1传至第80代，在ORF5a内部有4个氨基酸的插入，暗示ORF5a蛋白胞外区的长度改变对ORF5a蛋白的功能影响较小【351。在2型PRRSV中，Cys29突变为丝氨酸或甘氨酸对病毒的生长影响不大，说明Cys29对ORF5a蛋白结构及功能基序中不起关键作用。Cys29推测还处在ORF5a蛋白的跨膜区中，中性及碱性的氨基酸替代没有影响蛋白的结构。Cys30突变为丝氨酸对病毒生长影响较大，暗示Cys30可能为ORF5a蛋白功能的关键位点。如图4．7所示，动脉炎病毒的ORF5a蛋白中，除EAV外其它病毒的ORF5a蛋白在预测的跨膜区附近均存在保守的半胱氨酸。推测该位点可能不形成二硫键但在OI强5a蛋白结构中起重要作用。以前研究表明，病毒结构蛋白之间共价键形式的相互作用可以提高病毒例子的稳定性[13-171。在有囊膜的病毒中，与核衣壳蛋白或M蛋白相互作用的蛋白有助于病毒粒子的包装【l引。我们虽然没有检测到ORF5a蛋白形成二硫键形式的相互作用，但是我们图4．5的双分子互补荧光实验说明，ORF5a蛋白同源二聚体的形成对PRRSV病毒的感染性是必须的。暗示ORF5a蛋白形成二聚体可能为病毒组装的偏好性。ORF5a蛋白的C端存在一个保守的碱性氨基酸RQ基序，推测OR5a蛋白的C端可能与病毒的RNA或N蛋白之间存在相互作用1361。在表达ORF5a的PAM细胞中共有16种蛋白差异表达【261。这些蛋白参与调节细胞的生长、细胞骨架的形成、细胞信号传递、新陈代谢、蛋白质的合成、RNA加工以及转录等方面调控。而ORF5a蛋白与病毒其它囊膜蛋白之间相互作用关系仍未知，解析清楚ORF5a蛋白与病毒其它囊膜蛋白之间相互作用将对ORF5a蛋白在病毒囊膜上的存在形式更为清楚，将有利于更深入的了解ORF5a蛋白的功能及PRRSV病毒的复制过程。 第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究I雠2pRRSVjV险_LDVtP致AVVR2332PRRSvLV47885嘧88S一妒tv《强秘舔图4．7动脉炎病毒ORF5a蛋白二级结构对比㈣Fig．4．7TopologicalpredictionofORF5aproteinintype1andtype2PRRSV,LDV,EAVandSHFV85 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究参考文献[1]DeaS，GagnonCA，MardassiH，eta1．Currentknowledgeonthestructuralproteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virus：comparisonoftheNorthAmericanandEuropeanisolates[J]．ArchV[rol，2000，145(4)：659-688．[2】2CavanaghD．Nidovirales：anewordercomprisingCoronaviridaeandArteriviridae[J]．ArchVirol，1997，142(3)：629-633．[3]GonzalezJM，Gomez-PuertasP，CavanaghD，eta1．AcomparativesequenceanalysistorevisethecurrenttaxonomyofthefamilyCoronaviridae[J]．ArchVirol，2003，148(11)：2207．2235．[4】NelsenCJ，MurtaughMP,FaabergKS．Porcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruscomparison：divergentevolutionontwocontinents[J]．JVirol，1999，73(1)：270—280．【5】KroeseMVZevenhoven-DobbeJC，Bos—DeRuijterJN，eta1．Thensplalphaandnsplpapain-likeautoproteinasesaleessentialforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusRNAsynthesis[J]．JGenVirol，2008，89(Pt2)：494—499．[6】MeulenbergJJ．PRRSV,thevirus[J]．VetRes，2000，31(1)：11-21．【7】VanAkenD，Zevenhoven·DobbeJ，GorbalenyaAE，eta1．Proteolyticmaturationofreplicasepolyproteinpplabythensp4mainproteinaseisessentialforequinearteritisvirusreplicationandincludesinternalcleavageofnsp7[J]．JGenVirol，2006，87(Pt12)：3473．3482．[8]FangYTreffersEE，LiYeta1．Efficient一2ffameshiftingbymammalianribosomestosynthesizeanadditionalarterivirusprotein[J]．ProcNatlAcadSciUSA，2012，[9】WuWH，FangYRowlandRR，eta1．The2bproteinasaminorstructuralcomponentofPRRSV[J]．VirusRcs，2005，114(1-2)：177-181．[10]JohnsonCR，GriggsTF,GnanandarajahJ，eta1．NovelstructuralproteininporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusencodedbyallalternativeORF5presentinallarteriviruses[J]．JGenVirol，2011，92(Pt5)：1107-1116．[11】WissinkEH，KroeseMVVanWijkHA，eta1．Envelopeproteinrequirementsfortheassemblyofinfectiousvirionsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J]．JVirol，2005，79(19)：12495-12506．[12]SunL，LiYLiuR，eta1．PorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusORF5aproteinisessentialforvirusviability[J]．VirusRes，2013，171(1)：178—185。 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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究[25]ShimozonoS，MiyawakiA．EngineeringFRETconstructsusingCFPandYFP叨．MethodsCeilBiol，2008，85(381-393．[26]0hJ，LeeC．ProteomiccharacterizationofanovelstructuralproteinORF5aofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J]．VirusRes，2012，169(1)：255-263．[27]HirokawaT，Boon-ChiengS，MitakuS．SOSUI：classificationandsecondarystructurepredictionsystemformembraneproteins[J]．Bioinformatics，1998，14(4)：378—379．[28]RostB，YachdavGLiuJ．ThePredictProteinserver[J]．NucleicAcidsRes，2004，32(WebServerissue)：W321—326．【291KaUL，KroghA，SonnhammerEL．Advantagesofcombinedtransmembranetopologyandsignalpeptideprediction一一thePhobiuswebserver[J]．NucleicAcidsRes，2007，35(WebServerissue)：W429-432．[30]MichelsonS．Consequencesofhumancytomegalovirusmimicry[J]．HumImmunol，2004，65(5)：465·475．【31]WoottonSK,YooD．Homo-oligomerizationoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnucleocapsidproteinandtheroleofdisulfidelinkages[J]．JVirol，2003，77(8)：4546—4557．【32]DelvalA，KrystkowiakP，Blatt几，eta1．AbiomechanicalstudyofgaitinitiationinHuntington'sdisease[J]．GaitPosture，2007，25(2)：279—288．【33]BayerTS，BoothLN，KnudsenSM，eta1．Arginine—richmotifspresentmultipleinterfacesforspecificbindingbyRNA[J]．RNA，2005，11(12)：1848-1857．[34]TanR，FrankelAD．Anovelglutamine—RNAinteractionidentifiedbyscreeninglibrariesinmammaliancells[J]．ProcNatlAcadSciUSA，1998，95(8)：4247-4252．【35]HanW，WuJJ，DengXYeta1．Molecularmutationsassociatedwiththeinvitropassageofvirulentporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J]．VirusGenes，2009，38(2)：276-284．【36]YooD，WooRonSK，LiGeta1．ColocalizationandinteractionoftheporcinearterivirusnucleocapsidproteinwiththesmallnucleolarRNA-associatedproteinfibrillarin[J]．JⅥrol，2003，77(22)：12173—12183． 第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)ORF5aproteincysteinesarenon—essentialAbstract：Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)openreadingframe(ORF)5containsasmallinternalORF5acapableofencodingaproteinof46or51aa,termedORF5aprotein．ThefunctionofORF5aproteiniscurrentlyunknown．TheORF5aproteinpossessestwocysteinesatpositions29and30thatarehighlyconservedamongNorthAmericanisolates．ThesignificanceoftheORF5aproteincysteineresiduesonvirusreplicationwasdeterminedusinganinfectiousclone．Eachcysteinewassubstitutedbyserineorglyeineandthemutationswereintroducedintoafull—lengthcloneofPRRSV．Whentransfe：ctedintoMARC．145cells，allserinemutantclonesinducedPRRSV．specificcytopathiceffectsandproducedinfectiousprogenyvirus．ThedataindicatethatcysteineresiduesintheORF5aproteinarenotessentialforreplicationofNorthAmericangenotypePRRSV．WhileCys30mutanttoglycineaffectedORF5aproteinshomodimerizationwhichiSessentialforvirusviability．Keywords：Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus；ORF5aprotein；cysteinemutation；disulfidelinkage 第五章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用的研究第五章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用的研究摘要：目前对于ORF5a蛋白与PRRSV其它结构蛋白相互作用关系仍不清楚。为了分析ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用关系，首先分析了在PRRSV感染MARC．145细胞过程中，ORF5a蛋白在MARC．145细胞中的定位，发现ORF5a蛋白主要定位于细胞的核周隙及细胞膜上，与病毒的其它结构蛋白有着类似的定位。接着，利用双分子互补荧光实验分析ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用发现，ORF5a蛋白可与GP4和2b蛋白有相互作用。采用免疫共沉淀实验证实了这个结果。综上所述，在本章中研究发现ORF5a蛋白与病毒的其它结构蛋白有着类似的定位且与病毒的GP4和2b蛋白有相互作用。这些结果为进一步了解ORF5a在病毒在复制过程的作用奠定基础。关键词：PRRSV；ORF5a蛋白；结构蛋白；蛋白互作PRRSV现已成为危害规模化养猪生产的主要疫病之一【lJ。目前对PRRSV的致病机制及诱导保护性免疫的机制还不是十分清楚。在2型PRRSVORF5中新发现一个小的ORF5a基因，编码46或51个氨基酸，称为ORF5a蛋白。我们在前期研究中发现，在两型PRRSV中ORF5a蛋白对PRRSV病毒的感染性是必须的，ORF5a蛋白的保守半胱氨酸对病毒复制是非必需的而ORF5a蛋白非共价键同源二聚体对PRRSV复制过程是必须的。PRRSV病毒粒子中还有其它7个结构蛋白：GP2(OI强2)，GP3(ORF3)，GP4(ORF4)，GP5(ORF5)，M(matrixprotein)(ORF6)，N(nucleocapsidprotein)(ORF7)以及小结构蛋白2b(ORF2b)[2-6J。GP2、GP3、GP4和GP5为定位于病毒囊膜的糖基化蛋白；M、2b、ORF5a蛋白为病毒囊膜上非糖基化蛋白。这些结构蛋白通过之间相互作用组装入病毒粒子。动脉炎病毒的组装是首先结构蛋白聚集在胞内膜上通过向高尔基体或者内质网腔隙(1umen)中出芽的方式完成病毒粒子组装【7驯。当前研究表明，动脉炎病毒的GP2，2b，GP3和GP4少量囊膜蛋白主要定位于感染细胞的内质网，暗示这些蛋白之间的相互作用关系【l01。在EAV中，2b蛋白发现定位于感染细胞的高尔基体和内质网膜上【3J。以前研究表明，2b可以帮助GP2，GP3和GP4 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究蛋白组成功能完全的的多聚体；GP2，2b，GP3和GP4组装完成后后由细胞的内质网转运至高尔基体[1l】。另外，研究报道2b蛋白和M蛋白有共定位关系，且M蛋白可以改变2b蛋白在细胞中的定位，暗示2b蛋白在包装出芽过程中需要M蛋白的帮助。在没有ORF2a．4的情况下，GP5、M和N蛋白可以形成病毒样粒子【l》141。尽管一系列直接或者对比研究证实PRRSV复制所必须的结构与非结构蛋白，但目前对于ORF5a蛋白与其它结构蛋白相互作用方面仍没有研究的十分清楚12’15,16J。OR5a蛋白的C端存在一个保守的碱性氨基酸RQ基序，推测OR5a蛋白的C端可能与病毒的RNA或N蛋白之间存在相互作用【l列。在表达ORF5a的PAM细胞中共有16种蛋白差异表达【181。这些蛋白参与调节细胞的生长、细胞骨架的形成、细胞信号传递、新陈代谢、蛋白质的合成、RNA加工以及转录等方面调控。在PRRSV感染MARC．145细胞后6小时检测到稀疏的荧光，12．24小时在细胞核周隙(perinuclear)检测到点状荧光，在细胞膜上或附近也可看到点状分布，这种荧光与N蛋白的细胞质分布区别明显扣J。而在最近一项研究揭示，在PAM细胞中表达ORF5a蛋白发现，ORF5a蛋白在细胞浆中均匀分布，没有出现重点定位在细胞核周隙(perinuclear)及细胞膜上或附近的现象【l引。由于两个实验在不不同条件下得出，ORF5a蛋白的具体定位还有待进一步研究。而ORF5a蛋白与病毒其它囊膜蛋白之间相互作用关系仍未知，解析清楚ORF5a蛋白与病毒其它囊膜蛋白之间相互作用将对ORF5a蛋白在病毒囊膜上的存在形式更为清楚，将有利于更深入的了解ORF5a蛋白的功能及PRRSV病毒的复制过程。1材料与方法1．1质粒、抗体和细胞2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染性克隆pAJXM根据JXMl00序列构建(GenBank登录号：GQ475526)由本实验室构建并保存。特异性识别两种基因型猪繁殖与呼吸综合征病毒N(nucleocapsid)蛋白的单克隆抗体(1AGll)由西班牙雅雷萨生物公司惠赠(IngenasaCompany，Madrid)；二抗AlexaFluor-568羊抗鼠IgG和AlexaFluor-555羊抗兔IgG；proteinA琼脂糖珠购Invitrogen公司；(USA)。特异性识别0I江5a蛋白的抗体，(识别肽段：CARQRQQQQQLSYSVD)定制自Abmart生物有限公司。HPR标记的羊抗猪二抗IgG购I刍Abcam公司。HA、MYC标签鼠源单克隆抗体Abmar生物有限公司。 第五章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用的研究非洲绿猴肾传代细胞MARC．145由本实验室保存。仓鼠肾传代细胞BHK．21(CCL．10)购自美国ATCC，由本实验室保存。1．2引物合成根据GenBank上公布的JXMl00(登录号：GQ475526)，运用Primer5．0软件设计并由上海捷瑞公司合成一系列引物(表5．1)。引物用无RNA酶的去离子水溶解为100pmol／L的贮存液，使用时稀释为10pmol／L的工作液。贮存液和工作液均保存于-20℃冰箱。 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究表5-1本研究用到的引物Table5—1Primersusedinthisstudy牛引物命名说明：前缀字母F代表正向引物，R代表反向引物，J表示序列来自JXMl00(GenBank登录号：GQ475526)卡斜体为引入限制性酶切位点。1．3RT-PCR和核酸测序检测病毒基因组具体方法参照第二章。1．4间接免疫荧光分析具体方法参照第二章。1．5生长动力学和空斑形态学分析具体方法参照第二章。 第五章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用的研究1．6免疫共沉淀实验1．6．1免疫共沉淀实验工作液配制：配制100ml的RIPAbuffer：(1)称取0．799的Tris．Base，0．9mg的NaCl加到75ml去离子水中，搅拌至全部溶解，用浓HCl调节PH值到7．4；(2)加10ml10％的NP．40；(3)加2．5ml10％的去氧胆酸钠，搅拌至溶液澄清；(4)加1mllOOmM的EDTA，用量筒定容到lOOml，2-8。C保存(5)蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用前加入：蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100I．tL；PMSF,Na3V04，NaF各500此。(PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。)在工作液中的终浓度：瞄s．HCI：50mM；pH7．4；NP．40：1％；去氧胆酸钠：O．25％；NaCI：150mM：EDTA：1mM；PMSF：1mM；抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂：各1删，Na3V04：1mM；NaF：1mM。1．6．2免疫共沉淀实验步骤实验准备：4"C预冷PBS，RIPABuffer，离心机。(1)转染后24—48h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液RIPA(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解30min，细胞裂解液于4"C，最大转速离心30min后取上清：(2)取少量裂解液以备Westernblot分析，剩余裂解液加llxg相应的抗体加入到细胞裂解液，4"C缓慢摇晃孵育过夜；(3)取lOI-tLproteinA琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000转／分，离心3min；(4)将预处理过的101xLproteinA琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃缓慢摇晃孵育2—4h，使抗体与proteinA琼脂糖珠偶连；(5)免疫沉淀反应后，在4"C以3000转／分速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用lml裂解缓冲液洗4次；最后加入15J_tL的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；(6)SDS．PAGE后，根据4．1．8的方法进行Westernblotting分析相互作用蛋白。 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究1。7双分子互补荧光实验(BiFC)根据文献报道的方法【l9，2⋯，我们采用点突变的方法在质粒pVeneus的基础上，拆分为pVN(包含Veneus蛋白N端173个氨基酸)和pVC(包含Veneus蛋白N端后173个氨基酸)两个部分。待检测的两个目的蛋白通过连接序YlJ(GGGGS)3【21’22】分别与pVN和pVC融合表达。双分子互补荧光实验(BiFC)实验方法采用实验室已发表文章方法【23|。6孔板中MARC．145长满平板约60％时共转染500ngBiFC质粒。在转染16小时后在荧光显微镜下观察。2结果2．1ORF5a蛋白定位分析有研究报道，在PRRSV感染MARC．145细胞后6小时检测到稀疏的荧光，12．24小时在细胞核周隙(perinuclear)检测到点状荧光，在细胞膜上或附近也可看到点状分布，这种荧光与N蛋白的细胞质分布区别明显【6】。而在最近一项研究揭示，在PAM细胞中表达ORF5a蛋白发现，ORF5a蛋白在细胞浆中均匀分布，没有出现重点定位在细胞核周隙(perinuclear)及细胞膜上或附近的现象【l引。由于两个实验在不不同条件下得出，为了进一步研究ORF5a蛋白的具体定位。我们首先在JXMl00感染MARC．145细胞后24小时后进行ORF5a蛋白检测，并且用DAPI将细胞核染色。如图5．1所示，在细胞核周隙(perinuclear)(DAPI将细胞核染为蓝色)检测到点片状荧光；在细胞膜上或附近也可看到点状分布。 第五章猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用的研究■■盈—0图5-1在JXMl00感染的MARC．145细胞中分析ORF5a蛋白定位Fig5-1SubcellularlocalizationoftheORF5aproteinininfectedMARC-145cells2．2ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白研究前面研究发现，在JXMl00感染MARC．145细胞后24小时检测ORF5a蛋白，ORF5a蛋白定位在细胞核周隙(perinuclear)及细胞膜上或附近。这个定位与病毒的其它结构蛋白在定位上具有相似性，特别是病毒的少量囊膜蛋白。接下来我们进一步研究ORFSa蛋白与病毒其它囊膜蛋白的相互作用。将pAJXM中结构蛋白克隆如BiFC质粒VN和VC。在这些结构蛋白的C端通过一段连接序列连接到veneus的N端(VN)或C端(VC)。我们构建了J5a．VN／J5a．VC，JGP2．VN／JGP2．VC，JE．VN／JE．VC，JGP3．VN／JGP3．VC，JGP4．VN／JGP4．VC，JGP5．VN／JGP5．VC，JM．VN仃M．VC，JN．VN／JN．VC。在6孔板中MARC．145长满平板约60％时共转染500ngBiFC质粒。在转染16小时后在荧光显微镜下观察。如图5．2，所示J5a．VN／J5a．VC质粒对最为阳性对照可以看到在特异的荧光信号；VN和VC空载体转染作为阴性对照没有见到特 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究异荧光信号，证明实验方法具有特异性。从结果上看，ORF5a蛋白与2b和GP4有特异信号检测到，并且在互换VN、VC后仍有荧光信号。以上结果说明，利用BiFC的方法检测到ORF5a与2b和GP4存在相互作用。从相互作用位置上看，ORF5a与2b和GP4在细胞浆及细胞膜上均可检测到荧光信号，其中在细胞细胞核周隙(perinuclear)周围可见几处点状分布。图5．2ORF5a蛋白与PRRSV其它结构蛋白相互作用分析Fig5-2Bimolecularfluorescencecomplementation(BiFC)analysisofORF5ainteractedwithotherstructureproteins2．3OI江5a蛋白与2b、GP4蛋白相互作用验证上面的结果说明，利用BiFC的方法检测到ORF5a与2b和GP4存在相互作用。从相互作用位置上看，ORF5a与2b和GP4在细胞浆及细胞膜上均可检测到荧光信号，其中在细胞细胞核周隙(perinuclear)周围可见几处点状分布。说明ORF5a与2b和GP4同时也存在共定位关系。为了进一步证实ORF5a与2b和GP4存在相互作用关系。 第五章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用的研究采用免疫共沉淀实验验证ORF5a与2b和GP4存在相互作用关系。在pAJXM质粒中克隆出ORF5a、2b、GP4基因，连接入pCMV真核表达载体，并在其C端添加myc标签或HA标签，构建pCMV-5amyc、pCMV-GP4HA和pCMV-2bHA。pCMV-5amyc和pCMV-2bHA共转染MARC．145细胞48h后，提取蛋白，沉淀ORF5a蛋白或者2b蛋白及与其相互作用的蛋白复合物，并进行Westernblot检测(图5．3．A)。从图5．3．A可以看出，在单独转染pCMV-5amyc的情况下，利用HA抗体进行免疫沉淀后没有检测到ORF5a的表达(阴性对照)；在单独转染pCMV-2bHA的情况下，利用Myc抗体进行免疫沉淀后没有检测到2b的表达(阴性对照)。只有当pCMV-5amyc和pCMV-2bHA共转染后，在经myc抗体沉淀下来的ORF5a-myc相互作用蛋白复合物中，才可以检测到2b．HA的表达；在经HA抗体沉淀下来的2b．HA相互作用蛋白复合物中，才可以检测到ORF5a-myc的表达。结合我们前期双分子荧光互补实验的结果，表明ORF5a蛋白与2b蛋白之间具有相互作用。实验重复3次，结果均一致。如图5．3．B所示，用以上免疫共沉淀方法研究了ORF5a-myc蛋白与GP4．HA蛋白的相互作用，以单独转染作为阴性对照，pCMV-5amyc和pCMV-2bHA共转染后在经myc抗体沉淀下来的ORF5a-myc相互作用蛋白复合物中，才可以检测到GP4．HA的表达；在经HA抗体沉淀下来的GP4．HA相互作用蛋白复合物中，才可以检测到ORF5a-myc的表达。结合前期双分子荧光互补实验的结果，表明ORF5a蛋白与2b蛋白之间具有相互作用。实验重复3次，结果均一致。以上结果表明，通过免疫共沉淀实验，证实ORF5a蛋白与2b和GP4蛋白之间存在相互作用。 猪繁殖与呼吸综合征病毒0P,F5a蛋白结构与功能的研究A)2b．HA5a-mycHAmycHAmycHAmyc3讨论+鬻蒸繁j囊i蒸黍纂羹。一；§誊黼ij董；i戮Il；|鞋《糍蔫曩■■_霹曩图5．3ORF5a蛋白与2b、GP4蛋白相互作用免疫共沉淀实验Fig5-3Co—IPofORF5aproteinand2borGP4前人研究表明，在PRRSV感染MARC．145细胞后6小时检测到稀疏的荧光，12．24小时在细胞核周隙(perinuclear)检测到点状荧光，在细胞膜上或附近也可看到点状分布，这种荧光与N蛋白的细胞质分布区别明显16J。而在最近一项研究揭示，在PAM细胞中表达ORF5a蛋白发现，ORF5a蛋白在细胞浆中均匀分布，没有出现重点定位在细胞核周隙(perinuclear)及细胞膜上或附近的现象【l引。由于两个实验在不不同条件下得出，为了进一步研究ORF5a蛋白的具体定位。我们首先在JXMl00感染MARC．145细胞后24小时后进行ORF5a蛋白检测，并且用DAPI将细胞核。如图5．1所示，在细胞核周隙(perinuclear)(DAPI将细胞核染为蓝色)检测到点片状荧光；在细胞膜上或附近也可看到点状分布。我们利用双分子互补荧光实验分析ORF5a蛋白与其它囊膜蛋白相互作用过程中，荧光位置也为ORF5a蛋白的定位。如图5．2所示，在ORF5a蛋白在细胞浆中均匀分布，并没有没有出现重点定位在细胞核周隙(perinuclear)及细胞膜上或附近的现象。这一结果与在PAM中过表达ORF5a蛋白想似。研究表明PRRSV结构蛋白在感染过程中不进入细胞膜(plasmamembrane)是PRRSV的一种免疫逃避机制【241。综合两个结果，推测ORF5a蛋白本身可能没有特异的定位序列，所以在细胞中过表达ORF5a蛋白表现不出明显的定位特点。但在PRRSV复制过程中，病毒复制调控的影响，ORF5a的定位表现出一定的特点。目前，以PRRSV的结构蛋白瞬时表达法进行BiFC分析应用在分析PRRSV结构100H捧，m叩B∞珏A弦A弦A弦扎m扎mHm 第五章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用的研究蛋白之间相互作用以及与细胞蛋白之间相互作用应用广泛【23，25，26J。据以前的报道，使用Ⅵ甲的两种片段YNl55(N端1．154残基)和YCl55(c端155．238残基)的组合时许多互作蛋白的复合物形成时可以产生相对较亮的荧光信号【27l。我们在研究中发现，BiFC荧光一般较弱，几乎所有的组合均较对照Ⅵ叩荧光弱，这和前人的报道一致。在活细胞内由BiFC互作产生的荧光强度不到一个完整荧光蛋白产生荧光强度的10％[2引。我们在实验中采用VenusYNl73州端1．173残基)和YCl74(C端174．238残基)的组合，可以很好的展示病毒结构蛋白之间的相互作用，对于定位于胞膜的蛋白荧光信号也达到了一定的强度。利用双分子互补荧光实验和免疫共沉淀实验证实ORF5a蛋白与2b和GP4蛋白存在相互作用，推测ORF5a蛋白在少量囊膜蛋白多聚体中为重要的组成部分。在PRRSV中GP2、GP3、GP4和GP5为定位于病毒囊膜的糖基化蛋白；M、2b、ORF5a蛋白为病毒囊膜上非糖基化蛋白。这些结构蛋白对于病毒复制均为必须的【儿j。其中GP2，2b，GP3和GP4在病毒囊膜上的含量比较少，称为少量囊膜蛋白。它们在以前的研究中证实形成多聚体并且在动脉炎病毒入侵细胞中起重要作用【ll，29-32]。GP5在病毒囊膜中含量比较多，被称为大量囊膜蛋白。GP5与M蛋白之间存在二硫键介导的相互作用且被认为是诱导机体产生中和抗体的主要部分【30j。在没有ORF2-4的情况下，GP5、M和N蛋白可以形成病毒样粒子【12．14】。ORF5a蛋白与少量囊膜蛋白相互作用。暗示ORF5a蛋白在少量囊膜蛋白多聚体中起重要作用。当前研究表明，动脉炎病毒的GP2，2b，GP3和GP4少量囊膜蛋白主要定位于感染细胞的内质网【l01。在EAV中，2b蛋白发现定位于感染细胞的高尔基体和内质网膜上pj。以前研究表明，2b可以帮助GP2，GP3和GP4蛋白组成功能完全的的多聚体；GP2，2b，GP3和GP4组装完成后由细胞的内质网转运至高尔基体【11】。另外，M蛋白可以改变2b蛋白在细胞中的定位，而ORF5a蛋白与2b蛋白有着相互作用，暗示虽然ORF5a蛋白本身没有定位序列但可在病毒其它结构蛋白帮助下表现特异的定位。Das等研究表明，PRRSV的结构蛋白中GP4和GP2蛋白与其它的糖基化结构蛋白有相互作用；GP4蛋白介导少量囊膜蛋白多聚体的组装和介导和大量囊膜蛋白之间的相互作用(GP5)；GP4和GP2蛋白和病毒入侵细胞的受体CDl63相互作用【33I。这个结果说明GP4蛋白在病毒囊膜蛋白之间相互作用和病毒入侵细胞过程中起重要作用。虽然少量囊膜蛋白对于病毒粒子的包装是非必需的【l31，在病毒粒子上只有为数不多的少量囊膜蛋白多聚体【34J。这个结果暗示少量囊膜蛋白与大量囊膜蛋白在病毒囊膜形成的多聚体可以与细胞上特异受体相互作用在病毒入壳中起重要作用。ORF5a蛋白作为PRRSV少量囊膜蛋白多聚体的新成员其功能还不确定，深入研究ORF5a蛋白结构与功能对PRRSV防治具有重大意义。 猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5a蛋白结构与功能的研究参考文献[1]DeaS，GagnonCA，MardassiH，eta1．Currentknowledgeonthestructuralproteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virus：comparisonoftheNorthAmericanandEuropeanisolates[J]．ArchVirol，2000，145(4)：659—688．【2】2SnijderEJ，MeulenbergJJ．Themolecularbiologyofarteriviruses[J]．JGenVirol，1998，79fPt5)(961·979．【3]SnijderEJ，VanTolH，PedersenKW，eta1．Identificationofanovelstructuralproteinofarteriviruses[J]．JⅥrol，1999，73(8)：6335-6345．【4]WuWH，FangYFarwellR，eta1．A10-kDastructuralproteinofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusencodedbyORF2b[J]．Virology,2001，287(1)：183—191．[5]FirthAE，Zevenhoven—DobbeJC，WillsNM，eta1．DiscoveryofasmallarterivirusgenethatoverlapstheGP5codingsequenceandisimportantforvirusproduction[J]．JGenVirol，2011，92(Pt5)：1097-1106．[6】JohnsonCR，GriggsTF,GnanandarajahJ，eta1．NovelstructuralproteininporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusencodedbyallalternativeORF5presentinallarteriviruses[J]．JGenVirol，201l，92(Pt5)：1107—1116．[7】MagnussonP，HyllsethB，MarusykH．Morphologicalstudiesonequinearteritisvirus[J]．ArchGesamteVimsforsch，1970，30(2)：105·112．[8】StueckemannJA，HolthM，SwartWJ，eta1．Replicationoflactatedehydrogenase—elevatingvirusinmacrophages．2．Mechanismofpersistentinfectioninmiceandcellculture[J]．JGenⅥrol，1982，59(Pt2)：263-272．[9】WoodO，TaurasoN，LiebhaberH．Electronmicroscopicstudyoftissueculturesinfectedwithsimianhaemorrhagicfevervirus[J]．JGenⅥrol，1970，7(2)：129-136．[IO]YuM，LiuX，SunL，eta1．SubcellularlocalizationandtopologyofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusEprotein[J]．VirusRes，2010，152(1-2)：104．114．【11]WissinkEH，KroeseMV，VanWijkHA，eta1．Envelopeproteinrequirementsfortheassemblyofinfectiousvirionsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J]．JⅥrol，2005，79(19)：12495-12506．[12]MolenkampR，GreveS，SpaanWJ，eta1．EfficienthomologousRNArecombinationandrequirementforanopenreadingflameduringreplicationofequinearteritisvirus102 第五章猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用的研究defectiveinterferingRNAs[J]．JⅥrol，2000，74(19)：9062-9070．[13]WieringaRDeVriesAA，VanDerMeulenJ，eta1．Structuralproteinrequirementsinequineartedtisvirusassembly[J]．JVirol，2004，78(23)：13019-13027．【14]Zevenhoven-DobbeJC，GreveS，VanT01H，eta1．Rescueofdisabledinfectioussingle-cycle(OtSC)equineartefifisvirusbyusingcomplementingcelllinesthatexpressminorstructuralglycoproteins[J]．JGenVirol，2004，85(Pt12)：3709-3714．【15]DoklandT．111estructuralbiologyofPRRSV叨．VirusRes，2010，154(1-2)：86-97．【16]WangYLiangYHanJ，eta1．AttenuationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusstrainMN184usingchimericconstructionwithvaccinesequence[J]．Virology,2008，371(2)：418-429．[17]YooD，WoottonSK，LiGeta1．ColocalizationandinteractionoftheporcinearterivirusnucleocapsidproteinwitllthesmallnucleolarRNA—associatedproteinfibrillarin[J]．JVirol，2003，77(22)：12173-12183．[18]OhJ，LeeC．ProteomiccharacterizationofanovelstructuralproteinORF5aofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J]．VirusRes，2012，169(1)：255-263．[19]NagaiJ，KatsubeT，MurakamiT，eta1．Effectofgentamicinonpharmacokineticsoflysozymeinrats：interactionbetweenmegalinsubstratesinthekidney[J]．JPharmPharmacol，2002，54(11)：1491-1496．【20]NagaiT，IbataK，ParkES，eta1．Avariantofyellowfluorescentproteinwithfastandefficientmaturationforcell-biologicalapplications[J]．NatBiotechnol，2002，20(1)：87-90．【21]ShynYJ，LiuH，DengX，eta1．Identificationofnewfluorescentproteinfragmentsforbimolecularfluorescencecomplementationanalysisunderphysiologicalconditions[J]．Biotechniques，2006，40(1)：61—66．[22]ShimozonoS，MiyawakiA．EngineeringFRETconstructsusingCFPandYFP[J]．MethodsCellBiol，2008，85(381-393．[23]ZhangR，ChenC，SunZ，eta1．Disulfidelinkagesmediatingnucleocapsidproteindimerizationarenotrequiredforporcinearterivirusinfectivity[J]．JⅥrol，2012，86(8)：4670．4681．[24]CostersS，DelputtePL，NauwynckHJ．Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus—infectedalveolarmacrophagescontainnodetectablelevelsofviralproteinsintheirplasmamembraneandateprotectedagainstantibody-dependent，complement-mediatedcelllysis[J]．JGenⅥroI，2006，87(Pt8)：2341—2351．【25]WeiZ，LinT，SunL，eta1．N-linkedglycosylationofGP5ofporcinereproductiveand1n3 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白结构与功能的研究respiratorysyndromevirusiscriticallyimportantforvirusreplicationinvivo[Y]．JVirol，2012，86(18)：9941-9951．[26]WeiZ，TianD，SunL，eta1．InfluenceofN-linkedglycosylationofminorproteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusoninfectiousvirusrecoveryandreceptorinteraction[J]．Virology,2012，429(1)：l-11．[27]HuCD，ChinenovYKerppolaTK．VisualizationofinteractionsamongbZIPandRelfamilyproteinsinlivingcellsusingbimolecularfluorescencecomplementation[J]．MolCell，2002，9(4)：789·798．【28]KerppolaTK．Bimolecularfluorescencecomplementation(BiFC)analysisaSaprobeofproteininteractionsinlivingcells[J]．AnnuRevBiophys，2008，37(465-487．【29]FaabergKS，PlagemannPCtTheenvelopeproteinsoflactatedehydrogenase—elevatingvirusandtheirmembranetopography[J]．Virology,1995，212(2)：512—525．【30]SnijderEJ，DobbeJC，SpaanWJ．Heterodimerizationofthetwomajorenvelopeproteinsisessentialforarterivirusinfectivity[J]．JVirol，2003，77(1)：97-104．[31]WieringaR，DeVriesAA，RottierPJ．Formationofdisulfide—linkedcomplexesbetweenthethreeminorenvelopeglycoproteins(GP2b，GP3，andGP4)ofequinearteritisvirus[J]．JVirol，2003，77(11)：6216-6226．[32]TianD，WeiZ，Zevenhoven—DobbeJC，eta1．Arterivirusminorenvelopeproteinsareamajordeterminantofviraltropismincellculture[J]．JⅥr01，2012，86(7)：3701-3712．[33]DasPB，DinhPX，AnsariIH，eta1．TheminorenvelopeglycoproteinsGP2aandGP4ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinteract、肮tllthereceptorCD163[J]．JVirol，2010，84(4)：1731—1740．[34]TruongHM，LuZ，KutishGF,eta1．AhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusgeneratedfromaninfectiouseDNAcloneretainstheinvivovirulenceandtransmissibilitypropertiesoftheparentalvirus[J]．Virology,2004，325(2)：308—319．104 全文总结TheMinorEnvelopeproteins2bandGP4ofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusInteractwithORF5aproteinAbstract：Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)containsthemajorglycoprotein,GP5，aswellasthreeotherminor，namely，GP2a,GP3，andGP4，onthevirionenvelope，andfourothernon—glycoproteins2b，M，N，andORF5aprotein，allofwhicharerequiredforgenerationofinfectiousvirions．Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)openreadingframe(ORF)5containsasmallinternalORF5acapableofencodingaproteinof46or51aa,termedORF5aprotein．ThefunctionofORF5aproteiniscurrentlyunknown．TostudytheirinteractionswithORF5aprotein，wehaveclonedeachoftheviralstructureproteinsandexaminedtheirexpressionandinteractionwitheachotherintransfectedcellsby(BiFC)andCO-immunoprecipitation(CO．IP)assayusingmonospecificantibodies．Thebimolecularfluorescencecomplementation(BiFC)WasusedtostudyORF5aproteininteractionswithotherenvelopeproteins．OurresultsshowthatORF5aproteininteractedwithGP4and2bprotein，andtheseresultswereconfirmedintransfectedcellsbyCo-immunoprecipitation(Co-IP)assay．Keywords：PRRSV；ORF5aprotein；structureprotein105 全文总结1、以JXMl00为骨架构建的全长感染性克隆为基础，在ORF4／ORF5区间插入3或6个碱基病毒可以拯救病毒而4或5个碱基不能被拯救。对插入突变致死的突变体分析，推测ORF5a蛋白为PRRSV复制过程所必须；在2型PRRSVORF4／ORF5区间，成功插入阳性基因标识，为创制新型基因工程标记疫苗奠定了基础。2、以两型PRRSV全长感染性克隆的基础上，敲除ORF5a基因。敲除突变体没有拯救出突变病毒，而突变体病毒结构蛋白表达没有受到影响。通过转染ORF5a敲除突变体过程中共同转染ORF5a真核表达载体的顺式互补实验证实ORF5a蛋白为病毒感染性必须。最后，我们在pAJXM全长感染性克隆中研究了不同长度ORF5a对PRRSV病毒复制的影响，结果发现46个氨基酸的ORF5a生长速度明显快于延伸后的突变体，暗示ORF5a在病毒感染过程中起重要作用。3、感染性克隆pAJXM中半胱氨酸突全部或部分突变为丝氨酸(serine)，均拯救出了突变病毒。说明ORF5a蛋白的保守半胱氨酸对病毒感染是非必需的；接下来，我们将pAJXM中半胱氨酸突全部或部分突变为甘氨酸(glycine)，发现第30位突变为甘氨酸时无法拯救出病毒。随后，我们利用双分子互补荧光实验分析发现，ORF5a蛋白第30位突变为甘氨酸时影响ORF5a蛋白同源二聚体形成。4、分析ORF5a蛋白在MARC．145细胞中的定位，发现ORF5a蛋白主要定位于细胞的核周隙及细胞膜上，与病毒的其它结构蛋白有着类似的定位。接着，我们利用双分子互补荧光实验分析ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用发现，ORF5a蛋白可与GP4和2b蛋白有相互作用并采用免疫共沉淀实验进行了验证。 致谢致谢本文是在导师范红结教授、袁世山研究员和姚火春教授的悉心指导下完成的。感谢他们对我顺利完成论文的指导，感谢他们在做科研和做人上给我指引。衷心感谢我的导师，在我学习过程中谆谆教诲和悉心指导，恩师对我的学业和生活上的关怀与帮助，每当我遇到困难和挫折时，感谢恩师对我的鼓励和指导；感谢给我的勇气和信心。我所取得的每一点点成绩，都要首先归功于导师的辛勤培养，借此机会向尊敬的导师致以最衷心的感谢和最崇高的敬意!衷心感谢童光志研究员对我课题设计、论文撰写等提供的悉心指导及宝贵意见!感谢中国农业科学院上海兽医研究所为实验的顺利完成所提供的良好的实验条件!衷心感谢本实验室韦祖樟、郑海红、高飞、龙进学、郑浩、单同领等各位老师及刘长龙、谭菲菲、田德斌、邓宇、陆嘉琦、蔺涛、周艳、李燕华、张荣、刘萍、黄律、孙春清、张宏彪、陈春燕、尹扬等兄弟姐妹在实验、学习和生活上给我的关心与帮助，感谢大家共同努力营造的团结、和谐、愉快的实验室氛围。最后，感谢辛勤抚育我成长，给予无私奉献和极大关怀的父母、亲友们，感谢他们多年来对我的学习生活上的关心和帮助，感谢他们为我的求学之路作出的巨大牺牲和奉献，使我能在多年的求学生涯中潜心学业、不断进取。 硕博期间论文发表情况1．SunL1，LIY1，LIUR，eta1．PorcinereproductiveandreSpiratorysyndromevirusORF5aproteinisessentialforvirusviability【J]．VirusRes，2013，171(1)：178—85．2．SunL，RunxiaLiu,ZuzhangWei，XiaominWang，TingHuang，HuochunYao，HongiieFan半，ShishanYuan牛．BimolecularFluorescenceComplementationanalysistorevealPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)VP5aproteininteractionsininfectedcells．(insubmission)3．WangX，SunLichang，LIYeta1．Developmentofadifferentiablevirusviaaspontaneousdeletioninthensp2regionassociatedwitllcelladaptationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus川．VirusRes，2013，171(1)：150—60．4．WeiZ，LinT，SunLiehang，LiYWangX，GaoF，LiuR，ChenC，TongGYuanS．N·LinkedGlycosylationofGP5ofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusIsCriticallyImportantforVirusReplicationInVivo．JVir01．2012Sep；86(18)：9941-515．WeiZ，TianD，SunLichang，LinT，GaoF，LiuRTongGYuanS．InfluenceofN—linkedglycosylationofminorproteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusoninfectiousvirusrecoveryandreceptorinteraction．Virology．2012Jul20；429(1)：1—11．．6．LinT，LiX，YaoH，WeiZ，TanF，LiuR，SunLichang，ZhangRLiW：LuJ，TongGYuanS．Useofreversegeneticstodevelopanovelmarkerporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus．VirusGenes．2012Aug31．【Epubaheadofprint]7．ZhaiS，YueC，WeiZ，LongJ，RanD，LinT，DengYHuangL，SunLichang，ZhengH，GaoF，ZhengH，ChenS，YuanS．Hi曲prevalenceofanovelporcinebocavirusinweanlingpigletswithrespiratorytractsymptomsinChina．ArchHr01．2010Aug；155(8)：1313-78．刘闰夏，蔺涛，田德斌，韦祖樟，孙利厂，陆嘉琦，袁世山，童光志，猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a／ORF5重叠区的分离．中国动哟嘱镙绋撇J．2012．2，29．35．9．刘闰夏，蔺涛，韦祖樟，孙利厂，陆嘉琦，袁世山．猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白研究进展．动物压等褫J．2011．12，89．94．