《水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部口或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》并向狂会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：ｉ姑导师签名：兰日期： 符号说明英文缩写英文全称中文名称bpBasepair碱基对CDVCaninedistempervirus犬瘟热病毒dday天dNTPdeoxy-ribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸EBEthidiumbromide溴化乙锭ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验hHour小时LLiter升LPSlipopolysaccharide脂多糖minMinute分钟mLMilliliter毫升mol/Lmoleperliter摩尔/升PBSPhosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应rpmRoundsperminute转/分sSecond秒TAETris/acetate/(buffer）Tris/乙酸电泳缓冲液TaqThermusaquaticu水生热栖酶µLMicroliter微升 目录摘摘摘要要要...........................................................................................................................................IAbstract...................................................................................................................................III1.前前前言言言.......................................................................................................................................11．1绿脓杆菌的研究进展.......................................................................................................11.1.1病原学...............................................................................................................................21.1.2流行病学...........................................................................................................................21.1.3临床症状...........................................................................................................................31.1.4病理变化...........................................................................................................................41.1.5防治措施...........................................................................................................................41．2肺炎克雷伯氏菌的研究进展...........................................................................................41.2.1病原学...............................................................................................................................51.2.2流行病学...........................................................................................................................51.2.3临床症状...........................................................................................................................61.2.4病理变化...........................................................................................................................61.2.5防治措施...........................................................................................................................71.3大肠杆菌的研究进展..........................................................................................................71.3.1病原学...............................................................................................................................71.3.2流行病学...........................................................................................................................81.3.3临床症状...........................................................................................................................81.3.4病理变化...........................................................................................................................91.3.5防治措施...........................................................................................................................91.4葡萄球菌的研究进展..........................................................................................................91.4.1病原及概述.......................................................................................................................91.4.2流行病学...........................................................................................................................91.4.3临床症状和病理变化.....................................................................................................101.4.4防治措施........................................................................................................................101.5本研究的目的与意义.......................................................................................................102.材料与方法...........................................................................................................................11 2.1材料....................................................................................................................................112.1.1病料.................................................................................................................................112.1.2主要试剂........................................................................................................................112.1.3主要仪器........................................................................................................................112.1.4培养基及主要溶液的配制............................................................................................122.2方法...................................................................................................................................132.2.1细菌分离培养................................................................................................................132.2.2涂片染色镜检.................................................................................................................132.2.3生化试验........................................................................................................................132.2.4药敏试验........................................................................................................................142.2.5PCR鉴定.....................................................................................................................142.2.5.1引物设计...................................................................................................................142.2.5.2细菌全基因组DNA的提取......................................................................................142.2.5.4PCR反应条件.............................................................................................................152.2.5.5PCR产物的鉴定.........................................................................................................162.2.5.6PCR产物测序及构建系统发生树.............................................................................163.结果.......................................................................................................................................173.1绿脓杆菌的分离鉴定、药物敏感性等的分析...............................................................173.1.1细菌分离培养及染色镜检结果.....................................................................................173.1.2生化试验结果................................................................................................................173.1.3药敏试验结果................................................................................................................183.1.416SrRNA扩增结果........................................................................................................193.1.5同源性分析与系统发育分析结果................................................................................203.2克雷伯氏菌菌的分离鉴定、药物敏感性等的分析........................................................213.2.1细菌分离培养及染色镜检结果.....................................................................................213.2.2生化试验结果................................................................................................................223.2.3药敏试验结果................................................................................................................233.2.416SrRNA扩增结果........................................................................................................243.2.5同源性分析与系统发育分析结果................................................................................243.3大肠杆菌的分离鉴定、药物敏感性等的分析................................................................26 3.3.1细菌分离培养及染色镜检结果.....................................................................................263.3.2生化试验结果................................................................................................................273.3.3药敏试验结果................................................................................................................283.3.416SrRNA扩增结果........................................................................................................293.3.5同源性分析与系统发育分析结果................................................................................293.4葡萄球菌的分离鉴定、药物敏感性等的分析................................................................313.4.1细菌分离培养及染色镜检结果.....................................................................................313.4.2生化试验结果................................................................................................................323.4.3药敏试验结果................................................................................................................333.4.416SrRNA扩增结果........................................................................................................343.4.5同源性分析与系统发育分析结果................................................................................344.讨论.......................................................................................................................................365.结论.......................................................................................................................................396.参考文献...............................................................................................................................407.攻读学位期间发表论文情况及奖励...................................................................................468.致谢.......................................................................................................................................47 山东农业大学全日制硕士专业学位论文摘要近年来，随着经济的发展，山东省的毛皮动物养殖业发展非常迅速。目前山东省已成为我国毛皮动物养殖第一大省，现在毛皮动物饲养量约占全国的二分之一左右。但是随着我省毛皮动物养殖业集约化程度的逐渐提高，毛皮动物的发病率也持续上升已成为制约我国毛皮动物产业发展的重要因素，给毛皮动物养殖业造成了很大的经济损失。水貂出血性肺炎是严重妨碍水貂养殖业的重要疫病之一，疫情日趋严重。研究表明，犬瘟热病毒（Caninedistempervirus，CDV）、流行性感冒（Influenza）、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa，P.aeruginosa)、水貂克雷伯氏菌(1Klebsiellapeneumoniae1)、葡萄球菌（Staphylococcus）、大肠杆菌（EscherichiaColi）是引起水貂出血性肺炎的常见病原。本研究采用常规细菌分离鉴定技术，对109份患出血性肺炎的水貂的肺组织进行了细菌的分离鉴定。其中未能纯培养的有10株，可纯培养的有99株，纯培养的99株细菌在普通营养琼脂培养基上表现各种不同的生长形态。提取细菌基因组DNA后，釆用PCR方法利用细菌16SrRNA序列通用的引物16S-1492R和16S-27F进行扩增后测序获得菌株16SrRNA基因序列。用NCBI-BLAST软件，将测序序列在GenBank数据库中进行同源性检索分析，初步确定细菌的种属，再根据细菌在生化反应中表现的特性确定细菌种属。经过实验鉴定的结果表明，99株细菌中，其中31株克雷伯氏菌，该菌的检出率为28.4%(31/109)；13株绿脓杆菌，该菌的检出率为11.9%(13/109)；34株大肠杆菌，该菌的检出率为31.2%(34/109)；8株葡萄球菌,该菌的检出率为7.3%(8/109)；2株变形杆菌，3株粪肠球菌，2株奇异变形杆菌，2株芽孢杆菌，1株枸橼酸杆菌，1株弗氏柠檬酸杆菌，1株蜡样芽孢杆菌，1株橙黄微小杆菌。16SrRNA序列同源性分析结果表明，13株绿脓杆菌分离菌间的核苷酸序列同源性为84.2%-100%，其中，除SDP.a-9与其他12株间的同源性较低，在84.2%-87.3%之间，其他12株间的同源性相对较高。遗传演化分析结果显示SDP.A-9与其他12株同源性较低，处于第一分支。SDP.a-4和SDP.a-12亲缘关系较近，SDP.a-1和参考株DM5、s7ps5与同一小分支上亲缘关系较近。分离的31株克雷伯氏菌分离菌间的核苷酸序列同源性为75.2%-100%，SDKp8与其他30株同源性较低，为75.2%-76.6%。其余30株同源性均较高。遗传演化分析结果显示I 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查SDKp8与其余30株亲缘关系较远，处于第一分支。分离的34株大肠杆菌分离菌间的核苷酸序列同源性为96.3%-100%，同源性很高。遗传演化分析结果显示在进化关系上SDEco-4与其他33株亲缘关系较远，处于第一分支，其他33株处于第二分支，亲缘关系均较近。分离的8株葡萄球菌分离菌间的核苷酸序列同源性为97.3%-100%，SDSau-5与SDSau-6间的同源性较高，处于一个小分支。但sau5、sau6与其他六株的同源性较低。SDsau1、SDsau2、SDsau3、SDsau4、SDsau7、sau8六株之间的同源性较高，均在98%以上。遗传演化分析结果显示在进化关系上SDsau5与SDsau6亲缘关系较近，处于第一分支。SDsau2和SDsau3亲缘关系较近，和SDsau4亲缘关系较近，SDsau7与SDsau8亲缘关系较近。SDsau1、SDsau2、SDsau3、SDsau4、SDsau7、sau8六株处于进化树的第二分支。通过对检测菌株克雷伯氏菌进行药敏试验,发现该细菌对氟苯尼考，阿米卡星，头孢他啶，氧氟沙星等药敏感；通过对检测菌株绿脓杆菌进行药敏试验，发现该菌对头孢哌酮，链霉素，阿米卡星，头孢他啶，氧氟沙星等药敏感;通过对检测菌株大肠杆菌进行药敏试验,发现该细菌对头孢曲松，头孢噻肟，头孢他啶，阿米卡星，氟苯尼考等药敏感；通过对检测菌株葡萄球菌进行药敏试验,发现该细菌对阿莫西林，头孢噻肟，头孢哌酮，氨苄西林，氟苯尼考等药敏感。对病料进行解剖，发现主要以肺脏出血为主。对送检病料进行分子生物学检测，对水貂肺炎主要病原菌分析，表明克雷伯氏菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和葡萄球菌的感染率比较高，大多数对阿米卡星、头孢类的药物敏感，可根据病情进行对症治疗。本试验初步了解山东省各地区水貂出血性肺炎的病原菌的感染率，了解水貂出血性肺炎主要细菌病的病原及耐药性，为进一步防治水貂出血性肺炎提供依据。关键词：：：水貂；出血性肺炎；分离鉴定；16SrRNAII 山东农业大学全日制硕士专业学位论文EpidemiologicalInvestigationofBacterialPneumoniafromMinkAbstractInrecentyears,withthedevelopmentofeconomy,thefuranimalbreedingindustryinShandongprovincehasdevelopedveryrapidly.Atpresent,ShandongprovincehasbecomethefirstprovinceofChina'sfuranimalbreeding,furanimalhusbandryisnowabout1/2ofthecountry'stotal.However,withthegradualincreaseofthedegreeofanimalhusbandryinourprovince,theincidenceoffuranimalisalsorising.ThishasbecomeanimportantfactorrestrictingthedevelopmentofChina'sfuranimalindustry,whichcausedgreateconomiclossestothefuranimalbreedingindustry.Minkhemorrhagicpneumoniaisoneoftheimportantdiseasesseriouslyhindertheminkindustry,theepidemicismoreserious.Researchshowsthatthecaninedistempervirus,Influenza,Pseudomonasaeruginosa,Klebsiellapeneumoniae1,Staphylococcus,EscherichiaColiarecommonpathogenscausingminkhemorrhagicpneumonia.Thisstudyusesconventionalbacterialisolationandidentificationtechnology,isolationandidentificationofthebacterialpneumoniainminklungtissueof109patientswithhemorrhage.Amongthem,therewere10strainswhichcouldnotbepurified,but99strainscouldbeculturedinpureculture,Amongthem,99strainsofbacteriashoweddifferentgrowthformsonthecommonnutrientagarmedium.AftertheextractionofbacterialgenomicDNA,16SrRNAgenesequenceswereobtainedbyPCRmethodusingtherRNA16Ssequenceofthebacteriaandtheprimers16S-1492Rand16S-27Fwereamplifiedandsequenced.UsingNCBI-BLASTsoftware,thesequencingsequenceinthebankGenedatabaseforhomologysearchanalysis,preliminarydeterminationofspeciesofbacteria,andthenaccordingtothecharacteristicsofbacteriainbiochemicalreactionstodeterminethecharacteristicsofbacterialspecies.Theexperimentalresultsshowthat,the99strainsofbacteria,which31strainsofKlebsiellapneumoniaebacteria,thebacteriadetectionratewas28.4%(31/109);13strainsofIII 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查Pseudomonasaeruginosa,thebacteriadetectionrateof11.9%(13/109);34strainsofEscherichiacoli,andthebacteriadetectionratewas31.2%34/109;8strainsofstaphylococci,thebacteriadetectionrateof7.3%(8/109);2strainsofProteus,3strainsofEnterococcusfaecalis,2strainsofProteusmirabilis,twostrainsofBacillussp.,1strainofCitrobacterand1strainofCitrobacteracidbacilli,1strainofBacilluscereus,1strainoforangetinycoli.Theresultsofhomologyanalysisof16SrRNAsequenceshowedthat,the13strainsofbacteriaisolatedfromthenucleotidesequencehomologywas84.2%-100%,which,inadditiontoSDP.a-9andother12strainsoflowhomologybetween84.2%-87.3%andother12strainshomologybetweentherelativelyhigh.GeneticevolutionanalysisshowedthatP.A-9SDwasinthefirstbranchwiththeother12strains.P.a-4SDandP.a-12SDwerecloselyrelated,P.a-1DM5andthereferencestrainSD,s7ps5andthesamesmallbranchonthecloserelationship.Thenucleotidesequencesofthe31isolateswere75.2%-100%,KpSD8andtheother30strains,whichwere75.2%-76.6%.Theother30strainswerehighlyhomologous.GeneticevolutionanalysisshowedthatKpSD8andtherestofthe30strainsofthemoredistant,inthefirstbranch.Thenucleotidesequencehomologybetweenthe34strainsisolatedfromtheisolateswas96.3%-100%,andthehomologywasveryhigh.GeneticevolutionanalysisshowedthatEco-4SDandtheother33strainsintheevolutionaryrelationshipisfar,inthefirstbranch,theother33strainsinthesecondbranch,thegeneticrelationshipisrelativelyclose.Thenucleotidesequencesofthe8isolateswere97.3%-100%,andthehomologybetweenSau-5SDandSau-6SDwashigher,whichwasinasmallbranch.Butsau5,sau6andothersixstrainswithlowhomology.SDsau1,SDsau2,SDsau3,SDsau4,SDsau7andsau8amongthesixisolateswerehighlyhomologous,weremorethan98%.AnalysisresultsshowthattheevolutionaryrelationshipofSDsau5andSDsau6werecloselyrelatedinthefirstbranchofgeneticevolution.ClosetoSDsau2andSDsau3relationship,nearSDandsau4relationship,nearsau7andSDSDsau8relationship.SDsau1,SDsau2,SDsau3,SDsau4,SDsau7andsau8sixstrainsinphylogenetictreeofthesecondbranch.DrugsensitivitytestusedtodetectstrainsofKlebsiellapneumoniae,foundthebacteriatoflorfenicol,Amikacin,ceftazidime,levofloxacinanddrugsensitivity;throughdrugsensitivitytestforthedetectionofstrainsofPseudomonasaeruginosa,itisfoundthatthebacteriatocefoperazone,streptomycin,Amikacin,ceftazidime,levofloxacinanddrugIV 山东农业大学全日制硕士专业学位论文sensitivity;thedrugsensitivitytestforthedetectionofEscherichiacoli,foundthebacteriatoceftriaxone,cefotaxime,ceftazidime,Amikacin,florfenicolanddrugsensitivity;throughdrugsensitivitytestforthedetectionofStaphylococcusaureusstrains,itwasfoundthatthebacteriumofamoxicillin,cefotaxime,cefoperazone,ampicillin,florfenicoletc.drugsensitive.Thediseasewasdissectedandfoundmainlyinthelunghemorrhage.Ofdiseaseinspectionmaterialsformolecularbiologydetection.ThemainpathogenicbacteriaofpneumoniainminkanalysisshowgramsKlebsiella,Pseudomonasaeruginosa,bacillus,EscherichiacoliandStaphylococcusaureusinfectionrateisrelativelyhigh,mosttoamikacin,cefotaxime,drugsensitive,canbesymptomatictreatmentaccordingtotheillness.ThisexperimentpreliminaryunderstandingbleedingpneumoniapathogeninfectionrateofShandongProvincemink,understandingminkhemorrhagicpneumoniabacterialdiseasepathogensanddrugresistance,forfurtherpreventionandtreatmentofminkhemorrhagicpneumoniaandprovidethebasis.Keywords:mink;Hemorrhagicpneumonia;Separationidentification;16SrRNAV 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1.前言水貂是我国的重要特种经济动物，于1956年开始从国外引种水貂进行规模化人工养殖(郭天芬等，2006)，现在世界各国人工饲养的水貂品种都是美欧水貂的后代(涂剑锋等，2010)。自2004年以来，随着毛皮市场的繁荣，我国的养貂业迅猛发展，犹以山东半岛和江东半岛规模最为庞大，其丰富的渔业资源和气候条件是其规模形成的主要因素（孟洋，2015）。据威海晚报2013年12月报道，文登一个市的水貂存栏量就达到了1400万只，可见我国已成为名副其实的水貂养殖大国。但是随着养殖规模的不断扩大，养殖密度也不断增加，加上多年来的人工驯化，水貂的抗病能力越来越低（DemelL.2001）。水貂以肉类饲料为主，也加大了病毒、细菌、真菌和寄生虫等病原的感染几率（ElizabethS，2011）特别是病毒性和细菌性病原，容易引起传染病的大暴发和大流行，给养殖户带来巨大的经济损失，这也是制约当前水貂养殖业发展的关键因素(孙军防等，2001)。水貂细菌性肺炎是危害水貂养殖的重要疾病，该病在世界各地均有发生，我国因饲养密度大、管理水平落后等原因，致使该病连年发生，绿脓杆菌是引起出血性肺炎的主要病原菌（王学慧等，2006；王显峰，2009）,但近年来也有很多报道由其他病原菌引起水貂出血性肺炎的病例，Salomonsen等比较了水貂绿脓杆菌引起的出血性肺炎和溶血性大肠杆菌引起的出血性肺炎在组织学的变化（SalomonsenCM，2013）；梁业飞，胡本钢和杨艳玲等分别报到了由肺炎克雷伯氏杆菌引起的水貂出血性肺炎的病例（梁业飞，2011；胡本钢等2011；杨艳玲等2012）；刘自建等报道了由肺炎链球菌引起的水貂出血性肺炎的临床表现及防治方法(刘自建等，2013)；邹玲等对2007年山东等地发生的水貂出血性肺炎经微生物学检验最终确定由嗜血杆菌引起（邹玲等，2013）。以上研究报道表明，能够引起水貂细菌性肺炎的病原菌越来越多，且多数伴有出血症状，因此我们在对水貂出血性肺炎做诊断的时候不能仅依靠以往的经验，而必须经过微生物学的检查才能确定。下文分别从绿脓杆菌、克雷伯氏菌、大肠杆菌和葡萄球菌等四种病原菌的研究进展注意阐述如下:1．1绿脓杆菌的研究进展绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)又称铜绿假单胞菌，1882年Gersard首次从伤1 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查口脓液中分离得到（牛钟相等，2003）。绿脓杆菌是引起水貂肺炎的重要细菌性病原之一，水貂感染该细菌之后，主要特征为出血性肺炎和败血症，发病很急、死亡也快，一般呈地方性暴发，发病水貂死亡率常在1%-50%（Hammeretal.,2003）。该疾病主要通过空气传播，水貂易通过呼吸系统感染绿脓杆菌（Shimizuetal.,1974；Karlssonetal.,1971；Trautweinetal.,1962）。近些年来山东省的皮毛动物养殖业迅猛发展，但水貂疫病的发生率逐年上升，尤其是水貂肺炎的疫情日趋严重，严重妨碍了养貂业的健康发展，给养殖户和企业造成了重大的经济损失。1.1.1病原学绿脓杆菌为革兰氏阴性小短杆菌，需氧兼性厌氧，在分类学上归属于假单胞菌群Ⅰ。细菌体大小为（0.5～0.8）µm×（1.5～3.0）µm，常成双或单个存在，偶见呈短链存在。在电子显微镜下可见菌体一端有1根鞭毛也可看见很多菌毛，可以单向运动，菌体两端钝圆，无芽孢也无荚膜（牛钟相等，2003）。绿脓杆菌的全基因组大小约为6.2~7.1Mb（Silbyetal.,2011）。30～37℃为最适生长温度，可在42℃1正常生长，但在4℃不能生长。在普通营养培养基表面形成湿润、光滑、边缘整齐、带有金属光泽的中等菌落，但在培养基底部的细菌生长不良。在鲜血琼脂平板上形成淡黄白色、湿润、中等大小的菌落，绿脓杆菌能产生绿脓酶使红细胞溶解，37℃培养18h即出现β溶血环（周萍，2009）。外毒素A（PseudomonasaeruginosaexotoxinA，PEA）、蛋白水解酶、磷脂酶C、内毒素、1绿脓色素、碱性蛋白酶、外膜蛋白、1弹性蛋白酶、了细胞外酶S、纤毛、鼠李糖脂等绿脓杆菌的多种菌体成分和产物均在其致病性中起不同的作用，能广泛侵袭机体各个脏器组织，特别是肺脏，引起各种病变和炎症（Hommaletal.，1980；Liu，1974；Mutharia，1982；Woodsetal.，1983；Bleves，2011；Lauetal.，2004）。其中外毒素A毒性最强，是最主要的致病因子（杨理邦，1991）。1.1.2流行病学水貂肺炎是由绿脓杆菌等引起的一种急性败血性传染病，主要特征以出血性肺炎和败血症为主，发病很急，死亡也很快，一般呈地方性暴发，通常发病貂死亡率大于约在1%-50%（Hammeretal.，2003）。该疾病主要以空气为媒介进行传播，水貂很容易通过呼吸系统感染绿脓杆菌（Shimizuetal.，1974；Karlssonetal.，1971；Trautweinetal.，2 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1962），是严重威胁全世界养貂行业的重要细菌性疾病之一。1953年Knox1在丹麦第一次报道了水貂出血性肺炎（Knox，1953），我国于19841年第一次报告了水貂出血性肺炎（潘镰生等，1984），1此后水貂出血性肺炎在我国经常暴发，且自2000年以来肺炎疫情越来越严重。我国的山东、1河北、1辽宁、1内蒙古等多地先后暴发了水貂肺炎，给企业和养殖户造成了非常大的经济损失。2004年9月，山东省临沂市一个养殖户饲养的2161只水貂因绿脓杆菌引起了出血性肺炎，死亡67只，1死亡率31%1(王学慧等，2006)。2007年8月大连一个饲养水貂10万余只的养殖场，初期零星几只发出血性肺炎，因种种原因延误治疗时间,慢慢发展到每天都死亡80多只，至8月底病情得到完全控制时,总共死亡水貂1000多只（1罗国良等，2007）。12009年内蒙省扎兰屯市某水貂养殖场的350只水貂先后出现食欲废绝、剧烈咳嗽、呼吸困难等临床症状，最终确诊为出血性肺炎，死亡190只，死亡率达54%1(王显峰，2009)。2011年81月，河北省某县某个养殖户饲养的1500只水貂由绿脓杆菌引发了出血性肺炎，13d内水貂病死153只1(张贵贤等，2013)。2011年10月，江苏省某地某个水貂场900只水貂患细菌性出血性肺炎1，至送诊前已经死亡60多只，其中母水貂病死占病死水貂总数70%～80%1(任桥等，2012)。水貂肺炎主要多发于闷热的夏末秋初，昼夜温较差大而且又正值水貂脱毛换毛时期，脱落的貂绒毛对动物呼吸系统的刺激很大，且绿脓杆菌很容易在毛发中滋生繁殖，一旦健康水貂的抵抗能力力下降，大量滋生繁殖的绿脓杆菌趁机感染水貂，引起水貂发病1。绿脓杆菌所污染的各种日常饲料和水源以及病貂的粪便、尿、分泌物等都是本病的主要传染源，该病感染的主要途径是经过口腔和鼻（陈晨等，2015）1。幼龄貂因抵抗力低下较成年貂更容易感染1，据报道幼公貂的感染率明显高于幼母貂（初秀等，1999）。1.1.3临床症状水貂肺炎自然感染的潜伏期一般为19-481h，少数可达4-51d1。最急性型病程仅为几小时，感染水貂未见明显症状即突然死亡；急性型病程一般为1-121天1，也有的为41-5天，临床上大部分病例为急性型。急性型者一般表现为精神沉郁，食欲减退，体温升高，采食减少或完全停止，呼吸困难，大多呈腹式呼吸，并伴有异常的叫，水貂鼻镜干燥1，背毛粗乱，个别病貂眼部分泌物增多，爪子干燥肿大。病程后期病貂出现神经症状，全身抽搐、运动失调、尖叫，从鼻孔流出红色泡沫样液体、咯血，常于剧烈咳嗽和痉挛后死亡。大多粪便稀薄，呈黄绿色或者黑色，尿液呈铁锈色。多数患病水貂在出现病状后3 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查1-131d内死亡1（1汤天学等，2013；柴秀丽等，2008）。1.1.4病理变化病貂主要病变为肺部病变，整个肺叶出血、淤血、充血、水肿，有暗红色出血斑，肺叶呈深红或棕褐色肝样实1，切开后会流出大量泡沫状血样液体，病变更严重的会呈现出大理石样外观，放在水中会下沉，肺门淋巴结肿大出血；胸腔积液、胸膜会有纤维素性物；气管黏膜呈桃红色；心肌松弛、表面有大小不一的出血点；脾脏出血肿大、整个脾脏呈现暗红色、表面有黑色出血斑或出血点；肝脏肿胀、微黄、质脆易碎、充血；肾脏微肿、表面有出血斑或针尖大出血点、肾脏被膜结合不紧密易被剥落、皮质髓质均呈暗红色；胃和小肠前段含有血样内容物1，胃、肠黏膜脱、胃黏膜潮、有溃疡灶；肠黏膜有散在出血点、肠系膜淋巴结肿胀、出血；膀胱有出血点（于超等，2013；宋荣华等1，2011；宋雪梅，2011）。1.1.5防治措施加强饲养管理，提高水貂的抵抗力，还要注意环境卫生，发现病貂和可疑貂立即隔离，用药物进行治疗。对污染的食具、用具、笼舍要进行彻底消毒1(任桥等，2012)。夏季一定保证干净充足的饮水，貂棚做好降温防暑工作，搭防晒网，粪便按时清理。水貂退毛时，由于退下的绒毛中有绿脓杆菌，饲料和饮水很容易被到处飞扬的毛污染1，此时的水貂饮水和进食，以及环境消毒特别重要。特别时期加强消毒，炎热季节消毒每周3次1，可选用碘制剂和醛制剂交替使用。选择比较敏感的抗生素并配合葡萄糖、维生素C1、维生素B1进行辅助治疗（李明波等，2011）1。1．2肺炎克雷伯氏菌的研究进展肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapeneumoniae)属肠杆菌科肠道杆菌属克雷伯氏菌种,典型的条件致病菌，在自然界、人和动物体内广泛存在。正常情况下带菌动物不发病,但当机体抵抗力下降或本菌大量增殖时,就会引起动物发病甚至暴发性流行（郭万柱等，2001）。肺炎克雷伯氏菌是当前危害人类和动物最为严重的条件致病菌之一，可引起支气管炎、肺炎、泌尿系统和创伤感染、败血症、脑膜炎、腹膜炎等（1王世若等，19901；贾艳等，2007）。我国于1984年首次报告了水貂的出血性肺炎（高建新等，20091），4 山东农业大学全日制硕士专业学位论文此后水貂出血性肺炎在我国时有暴发。随着我国特种经济动物养殖业的迅猛发展，该病对毛皮动物的危害日益严重，同时该病对人类的危害也日益加剧，曾多次报道该病在人和动物中的发生和流行，且已日益被关注（潘镰生等，1984）。1.2.1病原学肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae)属于肠杆菌科(Entewbacteriaceae)克雷伯菌属(Klebsiella),分3个亚种：肺炎亚种，鼻炎亚种和鼻硬结亚种。同属的还有产酸克雷伯菌(K.oxytoca)1、土生克雷伯菌1(Kterrigna)、植生克雷伯菌1(Kphnticola)和变形克雷伯菌1(K.preteus)。本菌为两极染色，无鞭毛，无动力，无芽孢，多数菌株有菌毛，有较厚荚膜，革兰氏阴性粗短杆菌，大小0.3-1.01μm1x10.6-61μm。常呈成双、单个也有的呈短链状排列（王文旭，2014）。肺炎克雷伯杆菌为兼性厌氧菌，其代谢类型为氧化和发酵型。对培养要求很低，在普通营养培养基上(1含糖时)，可因产生呈灰白色大量荚膜物质、浓厚、圆凸、闪光、丰盛而黏稠湿润的黏液状大菌落，菌落之间常相互融合,用接种环常可拉出较长的丝。本菌生长温度范围为121—43°C,最适生长温度为37°C。肺炎克雷伯杆菌与其他肠杆菌科细菌一样,具有O和1K两种抗原。K11、K2型流行率较高,毒性较强1（1纪宏丽等，2010）。1.2.2流行病学肺炎克雷伯杆菌广泛分布于自然界，该菌近几年来，成为仅次于大肠杆菌的最重要的条件性致病菌，人和动物肠道、呼吸道、泌尿生殖道主要存在场所。当因一些客观因素机体免疫力降低或使用抗生素不当导致菌群失调时，可发生肺炎、脑膜炎、肝脓肿、肠炎、眼内炎、伤口感染、泌尿系统发炎、全身败血症等，发病死亡率极高给临床治疗带来了非常大的困难（1张诗渝，2013）。正因为肺炎克雷柏杆菌的广泛分布，该菌的感染也涉及到了各种动物。在我国台湾地区，造成化脓性肝脓肿的菌株中，以肺炎克雷伯杆菌最为常见，其分离率由早期的130%(1977年)1跃升至80%1(2004年)（贾艳等，2006）。从一例长期患病的幼体大熊猫肠5 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查炎粪便中分离出一株毒力极强的肺炎克雷伯氏杆菌（张成林等，1997）。2004年报道一起狐狸肺炎克雷伯杆菌病（韩庆安等，2005）。2011年从一例以高热、鼻流脓液、腹泻、呼吸困难为主要临床特征的疾病，剖检变化主要表现在呼吸系统，包括呼吸道黏膜充血、水肿，肺脏有充血、出血、气肿的梅花鹿体内分离到肺炎克雷伯杆菌（王书全，2011）。某吉林养殖场的水貂感染了水貂肺炎克雷伯氏菌病（赵传芳等，2005）。一起仔猪以高热、鼻流浓液、腹泻、呼吸困难、皮肤充血、腹部和两耳发紫为主要特征的疫病,被确诊为肺炎克雷伯（邓绍基等，1997）。一起由肺炎克雷伯杆菌引起小尾寒羊感染发病的病例（房海等，2005）。一起狄高鸭和北京鸭感染肺炎克雷伯杆菌的病例（朱煜兰，1989）。2004年一例肉鸡感染肺炎克雷伯杆菌的病例(金天明,2005)。1999至2000年初,浙江杭州地区某些养鳖场,发生一种严重的传染性疾病,最后被确诊为肺炎克雷伯（徐海圣等，2002）。1.2.3临床症状该病按发病症状可分为四个类型（陶福军等，2011）。1脓肿型1病貂全身出现小脓疱，尤其是颈部、肩部出现许多小脓疱，破溃后流出粘稠的带黄色的浓汁，形成瘘管，局部淋巴结形成脓肿。2蜂窝织炎型1喉部经常出现蜂窝织炎随后颈下可见相同症状，最终可延伸到肩部化脓肿大1。3麻痹型1食欲减退或废绝，后肢麻痹，步态不稳，出现症状后21-131d内多数病貂死亡。4急性败血型1突然发病，食欲骤减或完全废绝1，精神萎靡，呼吸困难1，在出现症状后很快死亡。1.2.4病理变化1脓疱型1体表可见脓疱，浓汁呈灰黄色或淡蓝黄色。内脏器官出现败血症1，充血1、淤血和各种营养不良等变化。2蜂窝织炎型1肝脏肿大明显，质硬且脆，易碎11，充血肿胀，可见淤血斑，切面有暗褐色的血液流出，且大面积凝固不良，脾脏肿大31-15倍，呈暗紫色，肺有明显脓肿。3麻痹型1病貂伴有膀胱内充满尿液呈黄色，黏膜肿胀且增厚，脾肾肿大。4急性败血型1病死水貂营养状况良好，死前有明显呼吸困难症状的病貂1，呈现化脓6 山东农业大学全日制硕士专业学位论文型，纤维素性肺炎和心内、外膜炎。脾肝肿大。肾有出血点或梗死。1.2.5防治措施加强饲养管理，严格把好饲料关，根据不同时期的营养要求制定适当的饲料配方，饲料应煮熟饲喂，禁止饲喂被病原微生物污染和霉败变质的饲料，定期对饲料脱霉，严格按照饲养卫生标准，保持貂舍清洁，勤通风勤换气，改善圈舍内环境。一旦出现咳嗽、流鼻、食欲减退、呼吸困难等症状要立即进行诊断、隔离、治疗；立即着手全群普查，及时发现病貂、采取相应的防控措施。搞好大环境卫生，制定严格消毒制度，禁用刺激性气味大的消毒液，定时清扫圈舍，保持貂舍内外环境卫生清洁。切断一切传播途径。搞好环境卫生，彻底清扫貂舍内外；加强消毒，可以选用聚维酮碘消毒液带畜消毒；及时隔离病貂。增强水貂抵抗力。饲料中可添加葡萄糖、包被VC1、电解多维等，以增加机体抵抗力。遵循“1三早”原则：“早预防，早发现，早治疗”，如若遇到病情特别严重、无治疗意义的水貂1，应该尽早淘汰。药敏试验：采集病料做药敏试验。通过药敏试验确定敏感药物进行使用，并尽早确定和淘汰无治疗价值的病貂，以减轻经济损失（贾照凯等，2014）。1.3大肠杆菌的研究进展大肠杆菌是Escherich在1885年发现的，但直到20世纪中叶才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性。1.3.1病原学大肠埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli1)1通常称为大肠杆菌，是一类能引起人和动物肠内、外疾病的重要人畜共患病病原体(1斯特劳等1，20001;Smithetal.,20071)。目前,学术界根据其遗传学和临床症状，将Ecoli分为3种类群:共生型、肠内致病型和肠外致病型(1Maynardetal.,20041)。肠外致病性大肠杆菌是近年来美国和欧洲学者相继报道、分析的一类危害严重的大肠杆菌，它们不能引起宿主的肠道性疾病1，但可通过其特有的毒力因子(菌毛、粘附素、细胞表面亚基、毒素、侵袭因子、铁相关蛋白等)和毒力岛(PAls)侵袭、定殖于胃肠外组织1，并诱发感染（Girardeauetal1,2003；7 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查Johnsonandstell1,2000；Johnsonetal,2002）。肠外致病性大肠杆菌能引起人或动物的泌尿系统感染、新生儿脑膜炎、败血症、肺1、心内膜炎和手术感染。粘附素对于定殖于呼吸道、尿道和胃肠道等粘膜表面，并致使感染的病原菌尤为重要。溶血素的产生常与泌尿道感染和肺炎有关。大肠杆菌为肠杆菌科，埃希氏杆菌属，革兰氏阴性无芽孢的杆菌，大小(0.31-1.01)µm×(1.0-6.0)1µm，多数菌种有鞭毛，能运动，致病性的大肠杆菌一般都有菌毛。本菌为需氧及兼性厌氧菌，在151-1451℃1均可生长，最适pH值为7.21-17.4。1.3.2流行病学肠外致病性大肠杆菌与其他致病型大肠杆菌并没有特定的血清型界限，但某些血清型的菌株具有流行优势，如Girardeau等(2003)报道，能致人、牛、猪肠外感染的血清型08，O11和O101已是优势血清型,同时Alam等(2006)报道O161型大肠杆菌在水生环境中存在，另外新生儿脑膜炎，致人泌尿道感染及禽也有其流行的血清型(orskov,1992;Sannesetal,2004;Smithetal,2007;Russoetal,2003)。房海等确诊了一起发生典型传染性鼻炎一化脓性纤维素性胸膜肺炎病例，结果除分离到主要的多杀性巴氏杆菌外，还分离到绿脓杆菌及肠杆菌科细菌（房海等，1991）。赫晓燕等报道了大肠杆菌引起獭兔的出血性肺炎（赫晓燕等，2000）。该病的发生有一定的季节性，北方多见于81-110月份，南方多见于61-19月份。自然条件下，各种年龄的水貂均可感染，一般在断奶18天左右幼貂最易感。1.3.3临床症状患病水貂精神沉郁，鼻镜干燥，流清鼻液，常伴有咳嗽，眼睛汪水流泪（赵纯德等，19891）。可视黏膜发绀或潮红，患病水貂常卧于小室内，卷曲成团，体温高至39.51-411℃，弛张热，呼吸困难，多数呈腹式呼吸，呼吸达601-180次1/1min，食欲废绝。日龄小的仔貂，多数发病急促，一般无典型症状出现，叫声乏力，尖而长，吮吸能力很差，甚至全失，吃不到奶，腹部不膨满1，死亡极快。成年病貂若不坚持治疗很快死亡。病程8-15d，治疗不及时或治疗不当病死率极高。8 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1.3.4病理变化死亡水貂体质状况良好，口角多有分泌物流出，剖开胸腔可见肺充血、淤血、大面积出血。其中肺尖叶症状表现最明显，肉变区散在分布于肺小叶之间，切面有血液流出呈暗红色，泡沫样粘液充满支气管，心扩张，心室内有多量血液，通常实质器官黏膜有泡沫样粘液（倪金花，2014）。1.3.5防治措施水貂大肠杆菌病多由饲养场内的饲养管理、饲料、环境卫生和气候变化等外界因素引起，因此，在饲养管理过程中防治大肠杆菌病，养殖场首先应注意饲养管理的把控，绝对不允许混群饲养，保持好饲养卫生，消毒意识常驻心间，做到定期消毒，减少环境中致病菌的含量，尽可能避免病菌对水貂的侵害。气候发生剧列变化时，可以适当使用药物预防。饲喂干净新鲜的饲料可以大大减少甚至避免水貂大肠杆菌病的发生（1倪金花等，2014）。对任何来源不明的动物性饲料，必须经高温加工处理后方可饲喂。水貂发生细菌病后应尽可能通过药敏试验筛选敏感药物，避免盲目投药（孙蓉蓉等，2015）。尽早确定和淘汰无治疗价值的病貂，进可能减轻经济损失。1.4葡萄球菌的研究进展1.4.1病原及概述葡萄球菌（1Staphylococcus）是革兰氏阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状，因此而得名。葡萄球菌多数无致病性，少数可导致疾病。葡萄球菌是最常见的化脓性球菌之一，医院交叉感染大部分来源与葡萄球菌，菌体直径约1.01μm左右，菌体稍成椭圆形或球形，排列似葡萄串状，但幼期培养的液体菌，常常分散，细菌细胞均单独存在；葡萄球菌无鞭毛，无运动能力；无芽胞，除极少数菌株可形成荚膜外其他一般不形成。碱性染料着色非常容易1，革兰氏染液染色为阳性（李琳等，2009）。葡萄球菌属包括至少50余种。葡萄球菌经常引起以呼吸道和肠道为主的疾病。1.4.2流行病学9 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查葡萄球菌病多发于比较暖和的季节，61-18月发病居多。1995年7月8日,临沂市重沟镇伏庄一村民带死貂于山东省临沂市河东区畜牧局确诊了一例葡萄球菌病（刘富龙等，1995）。03、07、08以后每年全国各地都有葡萄球菌的相关报道。1.4.3临床症状和病理变化临床症状：发病初期，病貂食欲大减甚至丧失，精神萎靡，蜷缩一角。后大多前肢屈曲，弓背，出现腹式呼吸。一些病貂从鼻和口腔内流出含有血液的粘性分泌物。发现症状后几小时内或一日内便死亡1。多数病貂死亡时有的角弓反张，部分病例会出现拉稀1、黑色粪便等。病例理化：病死水貂肺均充血肿大，且气管和支气管内都含有出血性粘液，肝脏黄染1、肿胀，并伴有灰白色粟粒状坏死灶，其它脏器一般无明显肉眼病变1；也有的水貂心内膜有出血点，脾脏稍肿大，肝肿胀呈土黄色（辛国升等，2008）。1.4.4防治措施对于本病的预防，首先要改善饲养管理，严格实行饲料兽医卫生监督，少喂或不喂生鸭架、海杂鱼等肉类饲料，提高动物抵抗力能有效地预防本病传染（1徐凤宇等，2006）。不要从污染毛皮动物饲养场进垫草和保温材料，最好用无刺的干草和刨花（关中湘等，1982）。因此当发生疫情时，在条件许可的情况下，一定要进行药敏试验，根据试验结果选择最佳治疗药物（邱浩，2009）。1.5本研究的目的与意义本研究采用常规细菌分离鉴定技术，对患出血性肺炎的水貂肺组织进行了细菌的分离鉴定，同时选择代表菌株，分别做了药敏、生化实验，以及PCR产物测序与构建系统发育树。本实验为水貂出血性肺炎的有效防治奠定理论基础并提供丰富的实验数据，减少该病给毛皮动物养殖业带来的经济损失。10 山东农业大学全日制硕士专业学位论文2.材料与方法2.1材料2.1.1病料山东诸城、文登、临沂、日照等地采集的109份新鲜患病水貂肺组织。2.1.2主要试剂葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、发酵鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇、水杨素、枸橼酸盐、硫化氢、精氨酸双水解酶、鸟氨酸、赖氨酸、尿素酶等15种细菌生化微量鉴定管、青霉素G（青）1、氨苄西林（氨）、阿莫西林（莫）头孢哌酮（必）、头孢噻肟(肟)、头孢曲松(菌30)、头孢他啶（欣30）、链霉素（链）、卡那霉素(卡)、庆大霉素(庆10)、阿米卡星（丁30）、四环素(四)、氟苯尼考（FFC）、克林霉素（克）、杆菌肽（杆）、氧氟沙星1(1嗪)、红霉素（红15）等17种药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司。2+dNTPs、TaqDNA聚合酶、10×PCRBuffer（含Mg）、MarkerDL2000、MarkerDL5000都购自宝生物(大连)工程有限公司；GelStain1购自全式金生物工程有限公司；细菌基因组1DNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司1；细菌1611SrDNA通用引物由生工生物工程1（上海）1股份有限公司合成。液体石蜡、无水乙醇、去离子水、氯化钠；异戊醇、甲醛、磷酸氢二纳、氯化钾、磷酸二氢钾、浓盐酸等常规试剂均为国产分析纯1，均购自天津市凯通化学试剂有限公司。2.1.3主要仪器酒精灯一次性无菌吸管、试管、培养皿、、接种环、接种针、酒精棉球、载玻片、盖玻片、玻璃涂布棒、离心管（1.5mL、5mL、50mL）、1ml注射器及5号针头、手术剪刀、研钵、镊子等。11 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查DYY-6C型电泳仪：北京六一仪器厂；显微照相系统：日本Nikon公司制造；超净工作台VS-1300-U型：江苏省苏州市净化设备总厂；PH仪PHSJ-4A型：上海市精密化学仪器厂；旋涡混匀器1：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；显数恒温水浴锅HH-4型：常州国华电器有限公司；隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；高压灭菌锅：日本SANYO有限公司；PCR1仪：美国1ABI1公司；TGL-16G1台式离心机1：上海安亭科学仪器厂1；凝胶成像分析系统1Gdldoc11EQ型：购自美国1BIO1-1RAD公司；PHS1-13C1型1PH1计：上海雷磁仪器厂；2.1.4培养基及主要溶液的配制普通琼脂培养基:称取琼脂15g1、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉粉3g,加蒸馏水950mL左右,用1mol/L的NaOH调节PH至7.3±0.1，加蒸馏水定容至11L1，121℃高压灭菌151min,当温度降至50℃左右倒板，4℃1保存备用。普通营养肉汤培养基1：称量氯化钠51g1、蛋白胨101g、牛肉浸出粉131g1，蒸馏水9501mL左右1，用1mol1/1L的NaOH调节PH至7.2±10.2，用蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌151min1，无菌分装至灭菌试管中，4℃1保存备用。草酸铵结晶紫溶液1：称取21g结晶紫，溶于201mL195％1乙醇中，制成A液；称取草酸铵0.81g，溶于801mL1蒸馏水内，制成B液；A液与B液混匀后再过滤，将过滤液装入广口棕色瓶避光保存，若发生沉淀则重配。革兰氏碘液1：先称取2g碘化钾，溶解于少量蒸馏水中，再加入1g碘，使之充分溶解，充分振荡使其摇匀，加蒸馏水，定容至300mL，装入广口棕色瓶避光保存，如果颜色变浅则重新配置。PH为7.2的0.01MPBS缓冲液：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二纳1.15g、磷酸二氢钾0.2g,加蒸馏水950mL左右,用1mol/L的HCL调节PH至7.2，加蒸馏水定容至11L，1211℃1高压灭菌15min,备用。12 山东农业大学全日制硕士专业学位论文电泳缓冲液（501×1TAE）：Tris12421g、57.11mL冰醋酸、0.51mol1/1LEDTA，三层滤纸过滤后加灭菌去离子水定容至11L，常温保存。使用时稀释50倍制备成工作液。2.2方法2.2.1细菌分离培养对从山东文登、诸城、临沂、日照等地区，采集的109份病料，将水貂肺组织表面用烧红的手术刀片进行烧烙，用无菌手术剪刀在烧烙表面剪开一个切口，然后将接种环探入切口内取样，划线接种于普通营养琼脂平板上，371℃培养181-124h，观察细菌生长情况和菌落特征，并挑选典型菌落进行纯培养。挑取纯培养后的单个菌落分别接种到普通营养肉汤培养基，观察生长特性。2.2.2涂片染色镜检用烧红的接种环取一铂耳无菌生理盐水于干燥、洁净的载玻片中央，再用灭菌的接种环挑取纯化生长181-1241h的单个典型菌落于载玻片中央与生理盐水混合涂布成大小适当的薄层放置一会使其自然干燥。待抹片自然干燥后，涂抹菌落的一面向上，其背面在酒精灯外焰上方迅速来回拖过3次进行固定。固定的作用一是使细菌牢牢附着于抹片上不易被水洗冲掉，二是杀死细菌便于着色。1目前最常用的细菌染色方法是革兰氏染色1，1具体操作步骤如下1：(1)1初染：在固定好细菌的载玻片上滴加适量草酸铵结晶紫染色液，初染1min后水洗。(2)1媒染：再滴加适量革兰氏碘液混匀，1min后水洗。(3)1脱色：加95％的乙醇，冲洗载玻片大约30s，直到无颜色往下脱落。(4)1复染：滴加适量的石碳酸复红，复染1min,然后清水冲洗。将染好的载玻片用吸水纸干燥，放到显微镜的载物台上用压片铗压好，调整显微镜视野，在载玻片染色处滴加一滴香柏油，使物镜的油镜镜头浸在香柏油内，调节粗准焦螺旋找到视野，然后调节细准焦螺旋，直到物象清晰，观察细菌染色情况及排列形态特征。2.2.3生化试验13 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查用接种针分别蘸取分离纯化后的菌株，分别接种到葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、发酵鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇、水杨素、枸橼酸盐、硫化氢、精氨酸双水解酶、鸟氨酸、赖氨酸、尿素酶等微量生化反应管，置灭菌平皿内，371℃培养241-1481h，观察颜色变化并根据生化鉴定管说明书判断结果。2.2.4药敏试验用灭过菌的接种环挑取分离纯化的单个菌落接种于51mL的普通营养肉汤培养基中，371℃1培养161-1181h制备成菌液。取0.1mL菌液于普通营养琼脂平板，然后用无菌涂布棒涂均匀，接着用无菌镊子取药敏纸片等距离贴在培养基表面，贴药敏纸片时与培养皿边缘不能太近，且药敏片间的圆心距应大于31cm，每次取药敏片之前镊子都要在酒精灯外焰上来回烧烙3次，待到接近室温时再夹取下一个药敏片，将培养基倒置于培养箱内，37℃培养18-24h。2.2.5PCR鉴定2.2.5.1引物设计根据GenBank上发表的细菌16srRNA基因序列设计一对引物(GreisenK等，1994)，27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'交由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物预期扩增片段大约为1500bp。2.2.5.2细菌全基因组DNA的提取按照细菌全基因组DNA1提取试剂盒1(1BacteriaGenDNAKit)(CW0552)说明书操作，具体操作如下：（1）取37℃培养24h的分离细菌菌液大约3mL于离心管,10000rpm离心1min,弃掉上清。（2）向离心管底部沉淀中加180µLBufferGTL,用移液枪慢慢吹打沉淀，使菌体重新悬浮。14 山东农业大学全日制硕士专业学位论文（3）加入20µL的ProteinaseK，充分上下颠倒震荡，56℃孵育15-20min，孵育期间大约每隔5min上下颠倒离心管，使菌体与试剂充分接触反应彻底。（4）加200µLBufferGL，充分涡旋震荡使其混匀。加200µL无水乙醇，上下颠倒并震荡，简短离心。（5）将上述步骤（4）所得溶液，全部转移到吸附柱中，10000rpm离心1min,弃掉收集管中离心下来的废液，将吸附柱重新放回到收集管中。（6）往吸附柱中加500µLBufferGW1（按说明书已加好无水乙醇），10000rpm离心1min,弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。（7）吸附柱中加500µL已加无水乙醇的BufferGW2，10000rpm离心1min,弃掉收集管中的废液，将吸附柱再次放回到收集管中。（8）12000rpm离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱于室温晾2min，以去除吸附柱内的乙醇。（9）最后将吸附柱重新置于一个新的无菌离心管中，向吸附柱中央悬空加60µLBufferGE，置于室温5min，10000rpm离心1min，收集DNA，-20℃保存。2.2.5.3PCR反应体系表1PCR反应体系Tab1.ThereactionsystemofPCR组成体积特异性上游引物2μL特异性下游引物2μL模板2μLdNTPMix（2.5mM）4μL2+10×PCRBuffer（含Mg）5μLTaqDNA聚合酶0.4µLddH2O34.6μL总计50μL2.2.5.4PCR反应条件15 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查按以下反应条件进行，95℃预变性5min;94℃变性40s;56℃退火50s;72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸10min。2.2.5.5PCR产物的鉴定（1）称取0.25g琼脂糖置于溶胶的小锥形瓶中，加入25mL1×TAE，加热使其融化，摇匀后待冷却备用。（2）将样品梳子插入倒胶槽内，梳子齿下缘要与胶槽底面保持适当缝隙防止加样过少。（3）向步骤（1）冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加2µL的GelStain。（4）将琼脂糖胶液缓慢倒入步骤（2）已插好梳子的胶床中，胶液温度不能太低也不能太高，且倾倒时不能产生气泡，约25min冷却凝固后轻轻移去梳子。（5）用移液器取6µLPCR产物与2µL6×LoadingBuffer混匀，移液枪与加样孔垂直或稍微倾斜，慢慢将混有LoadingBuffer的样品加入加样孔中，同时在适当位置加入DL2000。（6）加样后，将凝胶块放入带有1×TAE的电泳槽内，盖好盖，接通电源，在200V电压下，电泳25min左右。（7）取出步骤（6）凝胶块放入凝胶成像仪中，打开紫外灯，调整合适焦距后观察成像结果并保存照片。2.2.5.6PCR产物测序及构建系统发生树产物经鉴定后交由生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。利用BLAST对测序结果进行分析，确定参考菌株序列，使用DNAStar软件对分离菌与参考菌株的16SrRNA序列进行比较分析，绘制系统发育树。16 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.结果3.1绿脓杆菌的分离鉴定、药物敏感性等的分析3.1.1细菌分离培养及染色镜检结果本实验从109份送检病料中共分离到绿脓杆菌13株。分别命名为SDP.a-1、SDP.a-2、SDP.a-3、SDP.a-4、SDP.a-5、SDP.a-6、SDP.a-7、SDP.a-8、SDP.a-9、SDP.a-10、SDP.a-11、SDP.a-12、SDP.a-13。分离的绿脓杆菌在营养琼脂平板上均形成光滑、湿润、边缘整齐、有金属光泽的菌落（见图1A）且具有独特的芳香气味；接种至LB肉汤37℃培养24h，培养的肉汤呈黄绿色，混浊均匀，有菌膜形成；在42℃时具有生长能力，而在5℃不具生长能力。绿脓杆菌为革兰氏染色阴性，菌体长短不一、细长，两端钝圆、成对或单个排列的中等大小短杆菌（见图1B），与文献（牛钟相和李雅林，2003）中对绿脓杆菌形态和特征的描述均一致。图1分离菌培养特性及染色镜检结果Fig.1Culturecharacteristicsandmorphologicalobservationofthebacteriaisolates图1A分离菌在营养琼脂培养基上生长情况图1B分离菌株革兰氏染色镜检结果Fig.1ATheconditionofbacteriaisolatesonnutrientagarmedium.Fig.1BMorphologicalobservationoftheisolatesafterGramstaining3.1.2生化试验结果生化实验精氨酸双水解酶、鸟氨酸、赖氨酸、枸橼酸盐生化结果阳性，葡萄糖、乳糖、麦芽糖等均为阴性。分离菌的生化试验结果均与文献（陆承平，2001）对绿脓杆菌17 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查生化特性的描述相一致（见表2）。表2分离菌的生化鉴定结果Tab.3Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsofthebacteriaisolates试验test结果results试验test结果results葡萄糖-山梨醇-乳糖-精氨酸双水解酶+麦芽糖-鸟氨酸+甘露糖-赖氨酸+蔗糖-硫化氢-发酵鼠李糖-尿素酶-水杨素-枸橼酸盐+阿拉伯糖-Note:"+"standsforpositive;"-"standsfornegative3.1.3药敏试验结果分离的绿脓杆菌分别进行药敏试验，敏感性基本一致，药敏结果（见表3）根据（周庭银，2007）的标准进行判定。分离菌均对头孢他啶、头孢哌酮、头孢噻肟、氧氟沙星、庆大霉素和链霉素高度敏感；对青霉素、卡那霉素均耐药。表3分离菌株的药敏试验结果Tab.3Antibioticsensitivitytestofbacteriaisolates抑菌圈直径(mm)判定标准敏感性DiametersofthestandradSensitivity药物名称inhibitionzoneDrugs中度敏感耐药绿脓杆菌敏感SRI青霉素G0≥29—≤28R氨苄西林0≥1512-14≤11R阿莫西林0≥2114-20≤13R头孢哌酮24≥2116-20≤15S头孢噻肟19≥2315-22≤14I18 山东农业大学全日制硕士专业学位论文头孢曲松18≥2116-20≤15I头孢他啶21≥1815-17≤14S链霉素23≥1512-14≤11S卡那霉素13≥1814-17≤13R庆大霉素20≥1513-14≤12S阿米卡星23≥1715-16≤14S氧氟沙星21≥1613-15≤12S四环素12≥1915-18≤14R氟苯尼考12≥1813-17≤12R红霉素17≥2314-22≤13I克林霉素0≥2114-17≤14R杆菌肽0≥139-12≤8R注：S为敏感；I为中度敏感；R为耐药Note：S:SusceptibilityI:Intermediatesusceptibility;R：Resistance3.1.416SrRNA扩增结果用所设计的引物分别对分离的菌株扩增出1500bp的片段均与预期（1500bp)一致。图2绿脓杆菌16SrRNA基因扩增结果M：DL2000DNA分子质量标准1:SDP.a-1;2:SDP.a-2;3:SDP.a-3;4SDP.a-4;5:SDP.a-5;6:SDP.a-6;7:SDP.a-7;8:SDP.a-8;9:SDP.a-9;10:SDP.a-10;11:SDP.a-11;12:SDP.a-12;13:阴性对照;Fig.2Amplificationproductof16SrDNAgenebyPCRM：DL2000DNAMarker;1:SDP.a-1;2:SDP.a-2;3:SDP.a-3;4SDP.a-4;5:SDP.a-5;6:SDP.a-6;7:SDP.a-7;8:SDP.a-8;9:SDP.a-9;10:SDP.a-10;11:SDP.a-11;12:SDP.a-12;13:Negativecontrol;19 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查3.1.5同源性分析与系统发育分析结果16SrRNA基因扩增产物经测序后利用Blast进行比对，结果表明13株分离菌均为绿脓杆菌。将其序列进行同源性及系统发育分析，分析结果显示13株分离菌间的核苷酸序列同源性为84.2%-100%，其中，除SDP.a-9与其他12株间的同源性较低，在84.2%-87.3%之间外，其他12株间的同源性相对较高（见图3）。遗传演化分析结果显示SDP.A-9与其他12株同源性较低，处于第一分支。SDP.a-4和SDP.a-12亲缘关系较近，SDP.a-1和参考株DM5、s7ps5与同一小分支上亲缘关系较近。SDP.a-1和SDP.a-2、SDP.a-3虽然处于一个大分支上，但是关系还是比较远。SDP.a-1、SDP.a-2、SDP.a-3、SDP.a-4、SDP.a-5、SDP.a-6、SDP.a-7、SDP.a-8、SDP.a-10、SDP.a-11、SDP.a-12、SDP.a-13处于第二分支（见图4）。图3分离株16SrRNA基因序列的同源性分析Fig.316SrRNAgenesequencehomologyanalysisofthebacteriaisolates20 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图4分离菌16SrRNA基因系统进化树Fig.4Thephylogenetictreebasedon16SrRNAgenesequencesoftheisolates3.2克雷伯氏菌菌的分离鉴定、药物敏感性等的分析3.2.1细菌分离培养及染色镜检结果本实验从109份送检病料中共分离到克雷伯氏菌31株。分别命名为SDKp1、SDKp2、SDKp3、SDKp4、SDKp5、SDKp6、SDKp7、SDKp8、SDKp9、SDKp10、SDKp11、SDKp12、、SDKp13、SDKp14、SDKp15、SDKp16、SDKp17、SDKp18、SDKp19、SDKp20、SDKp21、SDKp22、SDKp23、SDKp24、SDKp25、SDKp26、SDKp27、SDKp28、SDKp29、SDKp30、SDKp31。分离的克雷伯氏菌，在营养琼脂平板上可因产生大量荚膜物质，而呈灰白色、浓厚、圆凸、闪光而湿滑黏稠的黏液状大菌落，培养时间过长菌落经常相互融合,用接种环常可拉出较长的丝。（见图5A）；接种至营养肉汤37℃培养一段时间后形成黏稠液体；本菌生长温度范围为12—43°C,最适生长温度为37°C。本菌为两极染色，无鞭毛，无动力，无芽孢，大多数菌株有长有菌毛，有较厚荚膜，革兰氏阴性粗短杆菌，大小0.3-1.0umX0.6-6um。常呈成双、单个或短链状排列，与文献（任桥等，2012）中对克雷伯氏菌形态特征的描述一致。（见图5B）21 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查图5分离菌培养特性及染色镜检结果Fig.5Culturecharacteristicsandmorphologicalobservationofthebacteriaisolates图5A分离菌在营养琼脂培养基上生长情况图5B分离菌株革兰氏染色镜检结果Fig.5ATheconditionofbacteriaisolatesonnutrientagarmedium.Fig.5BMorphologicalobservationoftheisolatesafterGramstaining3.2.2生化试验结果能发酵葡萄糖、乳糖麦芽糖、蔗糖、甘露醇产酸产气，不产硫化氢，分离菌的生化试验结果均与文献（秦绪伟，2013）对克雷伯氏菌生化特性的描述相一致（见表4）。表4分离菌的生化鉴定结果Tab.3Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsofthebacteriaisolates试验test结果results试验test结果results葡萄糖+山梨醇+乳糖+精氨酸双水解酶+麦芽糖+鸟氨酸-甘露醇+赖氨酸-蔗糖+硫化氢-发酵鼠李糖+尿素酶-水杨素+枸橼酸盐-阿拉伯糖+Note:"+"standsforpositive;"-"standsfornegative22 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.2.3药敏试验结果分离的克雷伯氏菌分别进行药敏试验，敏感性基本一致，药敏结果（见表5）根据（周庭银，2007）的标准进行判定。分离菌均对头孢他啶、阿米卡星、氧氟沙星、氟苯尼考等药高度敏感；对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、红霉素、克林霉素、卡那霉素等药均耐药。表5分离菌株的药敏试验结果Tab.5Antibioticsensitivitytestofbacteriaisolates抑菌圈直径(mm)判定标准敏感性DiametersofthestandradSensitivity药物名称inhibitionzoneDrugs中度敏感耐药克雷伯氏菌敏感SRI青霉素G0≥29—≤28R氨苄西林0≥1512-14≤11R阿莫西林0≥2114-20≤13R头孢哌酮13≥2116-20≤15R头孢噻肟13≥2315-22≤14R头孢曲松0≥2116-20≤15R头孢他啶18≥1815-17≤14S链霉素12≥1512-14≤11I卡那霉素0≥1814-17≤13R庆大霉素0≥1513-14≤12R阿米卡星17≥1715-16≤14S氧氟沙星16≥1613-15≤12S四环素0≥1915-18≤14R氟苯尼考22≥1813-17≤12S红霉素0≥2314-22≤13R克林霉素0≥2114-17≤14R杆菌肽0≥139-12≤8R注：S为敏感；I为中度敏感；R为耐药Note：S:SusceptibilityI:Intermediatesusceptibility;R：Resistance23 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查3.2.416SrRNA扩增结果用所设计的引物分别对克雷伯菌株代表株Kpn1、Kpn2、Kpn3、Kpn4扩增出的片段为1500bp的片段，均与预期（1500bp)一致。图6克雷伯氏菌16SrRNA基因扩增结果M：DL2000DNA分子质量标准1:Kpn1;2:Kpn2;3:Kpn3;4:Kpn4;5:空白对照Fig.6Klebsiellaproductof16SrDNAgenebyPCRM：DL2000DNAMarker;1:Kpn1;2:Kpn2;3:Kpn3;4:Kpn4;6:Negativecontrol;3.2.5同源性分析与系统发育分析结果16SrRNA基因扩增产物经测序后利用Blast进行比对，结果表明31株分离菌均为克雷伯氏菌。将其序列进行同源性及系统发育分析，分析结果显示31株分离菌间的核苷酸序列同源性为75.2%-100%，SDKp8与其他30株同源性较低，为75.2%-76.6%。其余30株同源性均较高（见图7）。遗传演化分析结果显示SDKp8与其余30株亲缘关系较远，处于第一分支。SDKp1、SDKp2、SDKp3、SDKp4、SDKp5、SDKp6、SDKp7、SDKp9、SDKp10、SDKp11、SDKp12、、SDKp13、SDKp14、SDKp15、SDKp16、SDKp17、SDKp18、SDKp19、SDKp20、SDKp21、SDKp22、SDKp23、SDKp24、SDKp25、SDKp26、SDKp27、SDKp28、SDKp29、SDKp30、SDKp31这30株之间亲缘关系较近，处于第二分支（见图8）。24 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图7分离株16SrRNA基因序列的同源性分析Fig.716SrRNAgenesequencehomologyanalysisofthebacteriaisolates25 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查图8分离菌16SrRNA基因系统进化树Fig.8Thephylogenetictreebasedon16SrRNAgenesequencesoftheisolates3.3大肠杆菌的分离鉴定、药物敏感性等的分析3.3.1细菌分离培养及染色镜检结果本实验从109份送检病料中共分离到绿脓杆菌34株。分别命名为SDEco-1、SDEco-2、SDEco-3、SDEco-4、SDEco-5、SDEco-6、SDEco-7、SDEco-8、SDEco-9、SDEco-10、SDEco-11、SDEco-12、SDEco-13、SDEco-14、SDEco-15、SDEco-16、SDEco-17、SDEco-18、SDEco-19、SDEco-20、SDEco-21、SDEco-22、SDEco-23、26 山东农业大学全日制硕士专业学位论文SDEco-24、SDEco-25、SDEco-26、SDEco-27、SDEco-28、SDEco-29、SDEco-30、SDEco-31、SDEco-32、SDEco-33、SDEco-34。37℃恒温培养18-24h，在营养琼脂板上有圆形、隆起、光滑湿润、半透明、淡灰色或乳白色中等菌落生长（见图9A）且具有发臭气味；接种至营养肉汤37℃培养24h，程均匀混浊，管底有粘性沉淀，液面管壁有菌环，与文献（刘德稳，2012）描述一致。分离菌革兰氏染色均为阴性，，两端钝圆、无荚膜的杆菌（见图9B），与文献（邢兰君，2008）中对大肠杆菌形态特征的描述一致。图9分离菌培养特性及染色镜检结果Fig.9Culturecharacteristicsandmorphologicalobservationofthebacteriaisolates图9A分离菌在营养琼脂培养基上生长情况图9B分离菌株革兰氏染色镜检结果Fig.9ATheconditionofbacteriaisolatesonnutrientagarmedium.Fig.9BMorphologicalobservationoftheisolatesafterGramstaining3.3.2生化试验结果葡萄糖、乳糖、麦芽糖、山梨醇等生化阳性，蔗糖、水杨素、赖氨酸、硫化氢生化阴性。分离菌的生化试验结果与文献（杨青，等2015）对大肠杆菌生化特性的描述相一致（见表6）。27 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查表6分离菌的生化鉴定结果Tab.6Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsofthebacteriaisolates试验test结果results试验test结果results葡萄糖+山梨醇+乳糖+精氨酸双水解酶-麦芽糖+鸟氨酸-甘露糖+赖氨酸-蔗糖-硫化氢-发酵鼠李糖+尿素酶-水杨素-枸橼酸盐-阿拉伯糖-Note:"+"standsforpositive;"-"standsfornegative3.3.3药敏试验结果分离的大肠杆菌分别进行药敏试验，敏感性基本一致，药敏结果（见表7）根据（周庭银，2007）的标准进行判定。分离菌均对头孢他啶、头孢曲松、阿米卡星、和氟苯尼考高度敏感；对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、卡那霉素、四环素、克林霉素、杆菌肽均耐药。表7分离菌株的药敏试验结果Tab.7Antibioticsensitivitytestof5bacteriaisolates抑菌圈直径(mm)判定标准敏感性DiametersofthestandradSensitivity药物名称inhibitionzoneDrugs中度敏感耐药大肠杆菌敏感SRI青霉素G0≥29—≤28R氨苄西林0≥1512-14≤11R阿莫西林0≥2114-20≤13R头孢哌酮18≥2116-20≤15I头孢噻肟22≥2315-22≤14I头孢曲松25≥2116-20≤15S28 山东农业大学全日制硕士专业学位论文头孢他啶21≥1815-17≤14S链霉素14≥1512-14≤11I卡那霉素0≥1814-17≤13R庆大霉素13≥1513-14≤12I阿米卡星20≥1715-16≤14S氧氟沙星15≥1613-15≤12I四环素0≥1915-18≤14R氟苯尼考20≥1813-17≤12S红霉素0≥2314-22≤13R克林霉素0≥2114-17≤14R杆菌肽0≥139-12≤8R注：S为敏感；I为中度敏感；R为耐药Note：S:SusceptibilityI:Intermediatesusceptibility;R：Resistance3.3.416SrRNA扩增结果用所设计的引物分别对所分离菌株的代表株SDEco-1、SDEco-2、SDEco-3、SDEco-4扩增出的片段为1500bp，均与预期（1500bp)一致。图1016SrRNA基因扩增结果M：DL2000DNA分子质量标准1:SDEco-1;2:SDEco-2;3:SDEco-3;4:SDEco-4;5:阴性对照Fig.10EscherichiaColiproductof16SrRNAgenebyPCRM：DL2000DNAMarker;1:SDEco-1;2:SDEco-2;3:SDEco-3;4:SDEco-4;5:Negativecontrol3.3.5同源性分析与系统发育分析结果29 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查16SrRNA基因扩增产物经测序后利用Blast进行比对，结果表明34株分离菌均为大肠杆菌。将其序列进行同源性及系统发育分析，分析结果显示34株分离菌间的核苷酸序列同源性为96.3%-100%，同源性很高（见图11）。遗传演化分析结果显示在进化关系上SDEco-4与其他33株亲缘关系较远，处于第一分支，其他33株处于第二分支，亲缘关系均较近（见图12）。图11分离株16SrRNA基因序列的同源性分析Fig.1116SrRNAgenesequencehomologyanalysisofthebacteriaisolates30 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图12分离菌16SrRNA基因系统进化树Fig.12Thephylogenetictreebasedon16SrRNAgenesequencesoftheisolates3.4葡萄球菌的分离鉴定、药物敏感性等的分析3.4.1细菌分离培养及染色镜检结果本实验从109份送检病料中共分离到葡萄球菌8株。分别命名为SDSau-1、SDSau-2、SDSau-3、SDSau-4、SDSau-5、SDSau-6、SDSau-7、SDSau-8.分离菌在营养琼脂平板上37℃恒温培养12-24h后，生长出淡灰色、不透明、圆形、隆起、光滑、边缘整齐的小菌落（见图13A）；接种至营养肉汤37℃培养24h，肉汤均匀混浊。分离菌革兰氏染色均为阳性，球菌，单个散在或成双存在，或多个短链状或长链状排列（见图13B）。31 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查图13分离菌培养特性及染色镜检结果Fig.13Culturecharacteristicsandmorphologicalobservationofthebacteriaisolates图13A分离菌在营养琼脂培养基上生长情况图13B分离菌株革兰氏染色镜检结果Fig13ATheconditionofbacteriaisolatesonnutrientagarmedium.Fig.13BMorphologicalobservationoftheisolatesafterGramstaining3.4.2生化试验结果生化试验结果显示葡萄糖、蔗糖尿、素酶生化反应阳性;乳糖、麦芽糖、甘露糖、鸟氨酸、赖氨酸等生化结果为阴性。（见表8）。表2分离菌的生化鉴定结果Tab.8Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsofthebacteriaisolates试验test结果results试验test结果results葡萄糖+山梨醇-乳糖-精氨酸双水解酶-麦芽糖-鸟氨酸-甘露糖-赖氨酸-蔗糖+硫化氢-发酵鼠李糖-尿素酶+水杨素-枸橼酸盐-阿拉伯糖-Note:"+"standsforpositive;"-"standsfornegative32 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.4.3药敏试验结果分离的葡萄球菌分别进行药敏试验，敏感性基本一致，药敏结果（见表9）根据（周庭银，2007）的标准进行判定。分离菌均对头孢他啶头孢哌酮、头孢噻肟、氧氟沙星、庆大霉素和氨苄西林、阿莫西林、阿米卡星、克林霉素等高度敏感；对青霉素、链霉素、红霉素、卡那霉素均耐药。表9分离菌株的药敏试验结果Tab.9Antibioticsensitivitytestof5bacteriaisolates抑菌圈直径(mm)判定标准敏感性DiametersofthestandradSensitivity药物名称inhibitionzoneDrugs中度敏感耐药葡萄球菌敏感SRI青霉素G24≥29—≤28I氨苄西林29≥1512-14≤11S阿莫西林35≥2114-20≤13S头孢哌酮30≥2116-20≤15S头孢噻肟33≥2315-22≤14S头孢曲松25≥2116-20≤15S头孢他啶20≥1815-17≤14S链霉素14≥1512-14≤11I卡那霉素15≥1814-17≤13I庆大霉素15≥1513-14≤12S阿米卡星21≥1715-16≤14S氧氟沙星23≥1613-15≤12S四环素10≥1915-18≤14R氟苯尼考27≥1813-17≤12S红霉素22≥2314-22≤13I克林霉素25≥2114-17≤14S杆菌肽0≥139-12≤8R注：S为敏感；I为中度敏感；R为耐药Note：S:SusceptibilityI:Intermediatesusceptibility;R：Resistance33 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查3.4.416SrRNA扩增结果用所设计的引物分别对分离的葡萄球菌扩增出的片段均为1500bp与预期（1500bp)一致。图14葡萄球菌16SrRNA基因扩增结果M：DL2000DNA分子质量标准1:SDSau-1;2:SDSau-2;3:SDSau-3;4:SDSau-4;5:SDSau-5;6:SDSau-6;7:SDSau-7;8:SDSau-8;9:阴性对照Fig.14Staphylococcusproductof16SrRNAgenebyPCRM：DL2000DNAMarker;1:SDSau-1;2:SDSau-2;3:SDSau-3;4:SDSau-4;5:SDSau-5;6:SDSau-6;7:SDSau-7;8:SDSau-8;9:Negativecontrol3.4.5同源性分析与系统发育分析结果16SrRNA基因扩增产物经测序后利用Blast进行比对，结果表明8株分离菌均为葡萄球菌。将其序列进行同源性及系统发育分析，分析结果显示8株分离菌间的核苷酸序列同源性为97.3%-100%，SDSau-5与SDSau-6间的同源性较高，处于一个小分支。但sau5、sau6与其他六株的同源性较低。SDsau1、SDsau2、SDsau3、SDsau4、SDsau7、sau8六株之间的同源性较高，均在98%以上（见图15）。遗传演化分析结果显示在进化关系上SDsau5与SDsau6亲缘关系较近，处于第一分支。SDsau2和SDsau3亲缘关系较近，和SDsau4亲缘关系较近，SDsau7与SDsau8亲缘关系较近。SDsau1、SDsau2、SDsau3、SDsau4、SDsau7、sau8六株处于进化树的第二分支（见图16）。34 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图15分离株16SrRNA基因序列的同源性分析Fig.1516SrRNAgenesequencehomologyanalysisofthebacteriaisolates图16分离菌16SrRNA基因系统进化树Fig.16Thephylogenetictreebasedon16SrRNAgenesequencesoftheisolates35 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查4.讨论水貂作为经济价值较高的珍贵毛皮动物，其毛皮产品深受世界各地消费者的喜爱。尤其最近几年，随着国家发展我国人均收入增长，生活水平不断提高，貂皮的需求量也随之增长，我国养貂业因此得到快速发展。因为山东省具有独特的气候特征与丰富的海洋饲料资源，逐步发展成我国最大水貂养殖省份。然而随着养貂业的逐渐发展，养殖规模的不断扩大，饲养密度的不断增加，养殖水平下降和饲养管理越来越粗放，导致各种各样的水貂疾病也随之而来，为我国水貂养殖业带来了巨大的潜在威胁。近几年来，水貂肺炎一直以来都是危害水貂养殖业发展的重要疾病之一，又因目前疫苗市场局面复杂，不同厂家不同疫苗纷纷投入市场，造成疫苗市场比较混乱，影响疾病的免疫接种效果。因此，为进一步优化目前水貂的养殖业现状，对水貂肺炎进行及时的流行病学调查十分重要。绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、水貂克雷伯氏菌(Klebsiellapeneumoniae)、葡萄球菌（Staphylococcus）、大肠杆菌（EscherichiaColi）均是条件性病原菌，广泛分布在自然界中，人和各类动物都有易感性。Knox（1953)第一次次报道了绿脓杆菌是引起水貂肺炎的致病菌，自此以后绿脓杆菌就一直被人们认为是造成水貂肺炎的重要病原。在实际生产中,很多人一见到肺有出血或淤血症状的剖检变化，就诊断此水貂所患疾病为“出血性肺炎”1，因此就按绿脓杆菌感染用药，结果治疗效果非常差。近来有研究表明（Salomonsenetal.,2013），绿脓杆菌本来对水貂不具有很强的致病性，水貂自身原因是水貂出血性肺炎发生的主要因素。比如运输、霉变的饲料、外界环境的应激以及自身亚健康等原因，引起的水貂本身抵抗力下降厉害，使其易于感染病原菌并发病；本实验从109份病料中，表现出肺炎症状的水貂肺脏中，分离到13株绿脓杆菌，其分离率为11.9％；其中31株克雷伯氏菌，该菌的检测率为28.4%，34株大肠杆菌，该菌的检测率为31.2%，8株葡萄球菌,该菌的检测率为7.3%，任慧英和邹玲（2009）报道从患有水貂出血性肺炎的肺脏中，只分离到了嗜血杆菌，未分离到绿脓杆菌，可以表明绿脓杆菌不是水貂患肺炎的唯一病原菌。在生产当中，有许多病原菌可引起水貂出血性肺炎，如水貂发生流感、犬瘟热、附红细胞体病时，水貂机体抵抗力下降厉害，很易继发绿脓杆菌、克雷伯氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌等细菌的继发感染。36 山东农业大学全日制硕士专业学位论文在我国的水貂养殖过程中，为了降低饲养成本，养殖户采取提前换毛1、提前取皮，多数养殖场和养殖户给水貂埋置退黑激素，因此水貂正常的生理代谢遭到了严重的破坏，同时在水貂换毛期间，脱落下来的毛在空气中，严重刺激了水貂的呼吸系统，再加上脱毛期正处于夏末秋初的闷热季节，大环境及动物自身体内存在的条件病原菌，趁机大量繁殖扩增；饲料因加工、运输及贮存不当，引起的营养不全面、发霉、变质酸败经常发生，长期饲喂久而久之导致动物机体抵抗力严重下降；环境污染及疫苗注射用具消毒不严格，使环境中的绿脓杆菌、克雷伯氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌等细菌经创口入侵到动物体内；一些养殖场饲养密度太高、饲养环境通风差散热慢，不注意日常的大环境消毒和病死动物及废弃物品的无害化处理，致使养殖大环境的病原微生物密度太高，上述因素均会引起大群细菌性肺炎的暴发流行。所分离的13株绿脓杆菌，均对头孢他啶、头孢哌酮、头孢噻肟、氧氟沙星、庆大霉素和链霉素高度敏感；这些药物也是目前人医临床上用于治疗绿脓杆菌感染的药物。13株绿脓杆菌均对对青霉素、卡那霉素均耐药，绿脓杆菌耐药的原因可能是其天然耐药的本性，也可能是由临床用药引起的（王春梅等，2011）。所分离的31株克雷伯氏菌，均对头孢他啶、阿米卡星、氧氟沙星、氟苯尼考等药高度敏感；对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、红霉素、克林霉素、卡那霉素等药均耐药。所分离的34株大肠杆菌，均对头孢他啶、头孢曲松、阿米卡星、和氟苯尼考高度敏感；对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、卡那霉素、四环素、克林霉素、杆菌肽均耐药。所分离的8株葡萄球菌，均对头孢他啶头孢哌酮、头孢噻肟、氧氟沙星、庆大霉素和氨苄西林、阿莫西林、阿米卡星、克林霉素等高度敏感；对青霉素、链霉素、红霉素、卡那霉素均耐药。在治疗发病水貂的过程中，应根据其药敏试验结果选择适合、敏感的药物，切勿滥用抗生素，以防细菌对多种药物耐药，增加治疗难度从而造成更大经济损失。近年来，161SrRNA的扩增及测定在细菌种属鉴定方面发挥着越来越重要的作用。16SrRNA是拷贝很多的，且非常容易大量获得，所有细菌均共有其保守区，其可变区还具有细菌种1、属的特异性，因此161SrRNA是各种细菌分类研究与鉴别中最理想的靶序列1(刘朝军1，2011；Sontakkeetal.1,20091)。本研究在传统细菌理化特性研究鉴定的基础上，进行了161SrDNA扩增及测序，对分离菌进行进一步鉴定（李桂平等，1998），充分验证了所分离细菌分别为绿脓杆菌、克雷伯氏菌、葡萄球菌、大肠杆菌，提高了检测结果的准确性，同时构建了系统发育树，明确了被检菌的分类位置，为疫苗研究开发奠定了基础。37 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查水貂肺炎大多急发且死亡快，治疗机会小，因此日常加强预防才是控制肺炎最有效的途径。目前预防水貂肺炎发生的重要手段之一是免疫接种疫苗，可将各地区流行血清型的菌株经过灭活，制备成多价灭活疫苗，免疫接种水貂群，目前，中国农业科学院特产研究所根据我国肺炎的流行特点已成功研制绿脓杆菌多价灭活疫苗（白雪等，2011）。除菌体灭活苗外，相关的组分疫苗和基因工程疫苗也在正在积极研制中。提高水貂自身免疫力是预防水貂肺炎发生的关键，所以平时还要加强对饮用水1、饲料的检验，保证水貂饮水安全及饲料营养的全面均衡，搞好饲养大环境卫生，只有形成科学规范的饲养管理方法，整个毛皮动物养殖行业才能收到良好的经济效益。总之，分离到13株绿脓杆菌、31株克雷伯氏菌、34株大肠杆菌、8株葡萄球菌,都能能够感染水貂并引起发病。绿脓杆菌的分离率只有11.9％，说明绿脓杆菌不是引起水貂肺炎的唯一致病菌，克雷伯氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌等也是水貂肺炎致病因素的重要一份子。我们将在今后的研究中，继续深入调查研究水貂肺炎的致病因素，为该病的防控提供理论支持。38 山东农业大学全日制硕士专业学位论文5.结论1.本研究成功分离到99株菌，证明绿脓杆菌、克雷伯氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌均是引起水貂出血性肺炎的病因之一。2.本研究表明绿脓杆菌不是水貂肺炎的唯一致病菌。3.本实验通过细菌分离鉴定，细菌培养，生化实验和药敏试验结果表明，水貂对大肠杆菌、克雷伯氏菌、绿脓杆菌和葡萄球菌的感染率比较高，大多数对头孢他啶敏感，可根据病情进行对症治疗。39 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查6.参考文献白雪，柴秀丽，闫喜军水貂出血性肺炎流行病学调查及绿脓杆菌疫苗研究进展[J].现代农业科技，2011，15:317-3陈晨，李朋,韩铠怿,宗晓晨,王贵升,谢之景.貂源绿脓杆菌的分离鉴定及其致病性[J].兽类学报,2015,02:196-202.柴秀丽,闫喜军,罗国良.水貂出血性肺炎的防治[J].特种经济动植物,2008,6:13-14邓绍基,路永泉.一起仔猪肺炎克雷伯氏菌病诊疗报告[J].广西农业科学,1997,6:301-302.房海，陈翠珍，王洪发.家兔传染性鼻炎-化脓性纤维素胸膜肺炎及病原检查[J].中国畜禽传染病，1991，61（6）：7-8房海,陈翠珍,张晓君,等.羊肺炎克雷伯氏菌感染症及病原菌检验与系统发育分析[J].中国人兽共患病杂志,2005,21(10):895-899.高建新,卢兆芸,涂俊凌,等.婴幼儿配方乳粉中检出肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种的报告[J].中国人兽共患病学报,2009,25(6):611-612.关中湘，王树志，陈启仁.毛皮动物疾病学［J］，北京:农业出版社，1982:381-383郭天芬,常玉兰,席斌.我国毛皮动物养殖业现状及发展的对策[J].畜牧兽医科技信息,2006(03).郭万柱,吴彤,陈瑶先.动物微生物学[M].成都:四川科学技术出版社,2001.韩庆安,郑丽丽,陶茂晖,等.狐狸肺炎克雷伯氏菌病的诊断与防治[J].中国兽医杂志,2005,41(5):49-50.赫晓燕，刘晋平，马海利.獭兔大肠杆菌性出血性肺炎的诊治[J].畜牧兽医杂志，2000，19（4）：7-8胡本钢,杜崇涛,雷连成,等.貂源肺炎克雷伯菌的分离与鉴定机.中国预防兽医学报,2011,33(8):598-600.纪宏丽.非肝脓肿来源的肺炎克雷伯杆菌的血清型不以Kl、K2型[M].中国医科大学,2010.贾艳,孙长江,韩文瑜,等.肺炎克雷伯菌研究进展[J].微生物学杂志,2006,26(5):75-78.40 山东农业大学全日制硕士专业学位论文贾艳.猪源肺炎克雷伯菌菌毛致病的分子基础及其免疫相关抗原表位的筛选[D].长春:吉林大学,2007.贾照凯,,王凤英等.水貂克雷氏菌病的诊断与防治[J].特种经济动植物,2014,4:207.金天明.肉鸡克雷伯氏菌病的病原分离鉴定及其防治[J].兽医临床,2005,11:46-47.梁业飞.水貂克雷伯氏杆菌感染的调查分析[J].特种经济动植物,2011,14(1):13.刘朝军.16SrRNA序列测定在细菌鉴定中的应用[J].军医进修学院学报,2011,32(7）：774-775.刘德稳.水貂大肠杆菌病的诊断与防治.中国兽医杂志[J]2012，48(10):56-57刘富龙，解自富.水貂葡萄球菌病的诊断与治疗［J］，中国农学通报，1997，13（2）：53刘自建,曲文燕,李永芳,等.水貂链球菌肺炎的诊治[J].山东畜牧兽医,2013,(12):90-90.李琳.葡萄球菌分离株肠毒素基因型分析及两种毒素的表达纯化[D].天津大学,2009.陆承平.2001.兽医微生物学．北京:中国农业出版社，274-275．李明波,王晓宁.水貂出血性肺炎的诊断与治疗[J].畜牧与兽医,2011,02:104.罗国良，田宏宇，张海玲，闫喜军，邵西群，王凤雪，钟伟.狐犬瘟热继发细菌感染的诊断及防治[J].经济动物学报,2007,2:121-122.孟洋.水貂肺炎病原菌的检测及绿脓杆菌多价灭活疫苗的制备与免疫研究，东北林业大学,2015.6倪金花，水貂大肠杆菌病的预防和治疗［J］，养殖技术顾问，2014(1):170牛钟相，李雅林.动物绿脓杆菌病研究进展[J].动物医学进展,2003,24(1):16-18.潘镰生,贺天笙，孟令新，房晓荣，郑丽敏.水貂假单胞菌脂多糖菌苗研制初报[J].经济动物学报,1984,1：1-3.秦绪伟.水貂克雷伯氏菌的诊断与治疗北方牧业养殖园区.综合.2013邱浩.水貂链球菌的分离鉴定与防治［J］，上海畜牧兽医通讯，2009(3):34-35任桥，李丽，邹本革，刘焕奇，张启迪，徐丽，毕可东.水貂出血性肺炎的诊治[J].中国畜牧兽医文摘,2012,28(2):177任桥，徐玉，刘焕奇，张启迪，毕可东.水貂出血性败血症继发克雷伯氏菌病的诊断与治疗.中国兽医杂志[J].201248(9):77-78斯特劳等主编[美].猪病学.第八版.(赵德明,张中秋,沈建忠译).北京:中国农业大学出41 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查版社,2000,9:369一406宋荣华，沈双，水貂出血性肺炎的诊断与治疗[J].畜禽业,2011,272:60-61宋雪梅.水貂出血性肺炎的诊治[J].兽医导刊,2011,10:59孙军防，夏振亮.水貂混合感染痢疾阿米巴、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌病的诊断［J］.畜牧与兽医.2001，33（5）：35-35汤天学，王建平，曲光宪.一起水貂绿脓杆菌性肺炎的诊治[J].特种经济动植物,2013,11:15-16陶福军.水貂克雷伯氏病的诊疗报告[J].山东畜牧兽医,2011,05:57.涂剑锋,王雷,邢秀梅,等.水貂细胞色素b基因(Cytb)克隆、序列分析及与則属动物的进化关系.农业生物技术学报,2010,05:975-980.王春梅，何启盖，操继跃.细菌多重耐药泵的研究进展［J］.畜牧兽医学报，2011,42(4)：455-467.王世若.兽医微生物学及免疫学[M].长春:吉林科学技术出版社,1990:8.王文旭.2014.水貂克雷伯氏菌病的诊断.[J].经济动物学报，2014（4）：72王显峰.一起水貂绿脓杆茵病的诊断与防制.养殖技术顾问,2009,(10):143.王学慧，张立富.绿脓杆菌引发出血性肺炎的诊治[J].黑龙江畜牧兽医,2006(8):77-78.王书全.一例梅花鹿肺炎克雷伯菌病的诊治[J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,2011,43(8):100.辛国升,李香.一起水貂葡萄球菌病的诊治[J].养殖技术顾问,2008,08:120-121.邢兰君.水貂大肠杆菌病的诊断与治疗[J].特种养殖,2008(2):33徐凤宇，王树志.水貂阿留申病概述［J］，经济动物学报，2006,10(2):106-110.徐海圣,舒妙安等.中华鳖肺炎克雷伯氏菌病的病原研究[J].浙江大学学报,2002,29(6):702-709.杨理邦.绿脓杆菌外毒素A的研究进展［J］.微生物学免疫学进展,1991，2:8-13.杨青、石有斐、陈静、王苗利、徐鸿、王贵升等.貂源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性研究,中国兽药杂志[J]2015,49(8):14-19杨艳玲,陈峙峰,王成福,等.水貂肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定[J],特产研究,2012,04:10-12.于超，刘海龙，邵芹，王志海.一例水貂出血性肺炎的诊治[J].养殖技术顾42 山东农业大学全日制硕士专业学位论文问,2013,12:203张成林,朱飞兵,张金国.克雷伯氏菌对大熊猫的致病性探讨[J].中国兽医科技,1997,27(4):40-41.张贵贤，李正本，李国华.水貂出血性肺炎的诊断与防治[J].畜牧与兽医,2013,45(3):108张诗渝.2013.肺炎克雷伯杆菌的分离鉴定及其对小鼠的致病性研究[D].南京农业大学，2013赵传芳,闫新华,王长凤,等.水貂克雷伯氏菌病的诊治[J].特种经济动植物,2005,5:44.赵纯德，应祯灏，王林志，等，舟山市三起水貂大肠杆菌病的诊治报告［J］，毛皮动物饲养，1989（4）：22-24周萍，徐汉春，甘伏生，曾玲秀，徐云秀，孟丽，周静娴.鸡绿脓杆菌的实验室诊断［J］.湖北畜牧兽医，2009（3）：35-36.周庭银.临床微生物诊断与图解[M].上海:上海科学技术出版社.2007:217朱煜兰.鸭肺炎克雷伯氏菌病的诊疗[J].中国兽医科技,1989,12:27-28.邹玲,任慧英.水貂出血性肺炎的微生物学检查[J].黑龙江畜牧兽医,2009,(1):92-93BlevesS.ProteinsecretionsystemsinPseudomonasaeruginosa:Awealthofpathogenicweapons[J].InternationalJournalofMedicalMicrobiology,2011,300(8):534-543.DemelL.Farmingminks-Alternativesformoreadequantkeepingwithinthecurrentcircumstances[J].DeutscheTierarztlicheWochenschrift,2001,108:135-139ElizabethS.Themink[J]Harvardrev,2005,28:29-29.GirardeauJP,LaliouiL,OuSaidAM,etal.ExtendedvirulencegenotypeofPathogeicEseheriehiacoliisolatescarryingtheafa-8oPeron:evidenceofSimilaritiesbetweenisolatesfromhumansandanimalswiththextraintestinalInfections.JClinMicrobiol,2003,41:218一226GreisenK,LoeffelholzM,PurohitA,etal.PCRprimersandprobesforthe16SrRNAgeneofmostspeciesofpathogenicbacteria,includingbacteriafoundincerebrospinalfluid[J].Journaofclinicalmicrobiology,1994,32(2):335.HammerAS，PedersenK，AndersenTH．ComparisonofPseudomonasaeruginosaisolatesfromminkbyserotypingandpulsed-fieldgelelectrophoresis[J].JVeterinary43 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查Microbiology,2003,94（3）：237-243.HommalJY.aclassofserum-sensitive,nontypablestrainsdeficientinlipopolysaccharideOsidechain［J］.InfectImmun1980(50):149JohnsonJR,StellAL.ExtendedvirulenecegenotypesofEscherichiacolistrainsFromPatientswithurosepsisinrelationtoPhylogenyandhostcomPrmiseJIfectDis,2000,181:261一272JohnsonJR,KuskowskiMA,O′BryanTT,etal.EpidemiologicalcorrelatesofVirulencegenotyPeandPhylogencticbackgroundamongEscheriehiacolibloodIsolatesfromadultswithdiverse-sourcebacteremia.JIfectDis,2002,185:1439-1447KarlssonKA,KullKE,SvanholmR.InfectionsinminkscausedbyPseudomonasaeruginosa[J].NordVetMed,1971,23(7):345–351.KnoxB.Pseudomonasaeruginosasomårsagtilenzootiskeinfektionerhosmink(Pseudomonasaeruginosaasthecauseofenzooticinfectionsinmink).NordVetMed,1953,5:731.LauGW,HassettDJ,RanH,KongF.TheroleofpyocyanininPseudomonasaeruginosainfection[J].TrendsMolMed,2004,10(12):599-606.LiuPV,ExtracellulartoxinsofPseudomonasaeruginosa［J］.JInfectDis,suppl.1974,130:95MaynardC,BekalS,SanschagrinF,etal.HeterogeneityamongvirulenceandantimierobialresistancegeneProfilesofextraintestinalEscherichiacoliisolatesofanimalandhumanorigin.JournalofClinicalMicrobioligy,2004,42(12):5444-5452OrskovF,OrskovI.EscheriehiacoliserotyPinganddiseaseinmanandanimals.CanJMicrobiol,1992,38:699-704RussoTA,JohnsonJR.MedicalandeconomicimpactofextraintestinalInfectionsduetoEseherichiacoli:foeusonanincreasinglyimportantendemicProblem.MierobesInfoct,2003,5:449一456SalomonsenCM,ChriélM,JensenTH,Rangstrup-ChristensenL,HøibyN,HammerAS.EffectofinfectiousdoseandseasonondevelopmentofhemorrhagicpneumoniainminkcausedbyPseudomonasaeruginosa［J］.TheCanadianJournalofVeterinaryResearch,2013,77(3):221–225.SalomonsenCM,BoyeM,HaibyN,etal.Comparisonofhistologicallesionsinminkwith44 山东农业大学全日制硕士专业学位论文acutehemorrhagicpneumoniaassociatedwithPseudomonasaeruginosaorEscherichiacoli[J].CanJVetRes.2013:77(3):199-204.SannesMR,KuskowskiMA,OwensK,etal.VirulencefactorProfilesandPhylogeneticbackgroundofEseheriehiacoliisolatesfromveteranswithbacteremiaanduninfectedcontrolsubjeets.JInfctDis,2004,190:2121一2128ShimizuT,HommaJY,AoyamaT,OnoderaT,NodaH.VirulenceofPseudomonasaeruginosaandspontaneousspreadofPseudomonaspneumoniainaminkranch[J].InfectImmun,1974,10(1):16–20.SilbyMW,WinstanleyC,GodfreySA,LevySB,JacksonRW.Pseudomonasgenomes:Diverseandadaptable[J].FEMSMicrobiolRev,2011,35(4):652-680.SmithJL,FratamicoPM,GuntherNW.ExtraintestinalPathogenicEseherichiacoli.FoodbornePathogDis,2007,4:134-163.SontakkeS,CadenasMB,MaggiRG,DinizPP,BreitschwerdtEB.2009.Useofbroadrange16SrRNAPCRinclinicalmicrobiology[J].JMicrobiolMethods,76(3):217-225TrautweinG,HelmboldtCF,NielsenSW.PathologyofPseudomonaspneumoniainmink[J].JAmVetMedAssoc,1962,140:701–704.WoodsDE,IglewskiBH.ToxinsofPseudomonasaeruginosa:newperspectives［J］.RevInfectDis,suppl.1983(4):7145 水貂主要细菌性肺炎的流行病学调查7.攻读学位期间发表论文情况及奖励文章：兔源金黄色葡萄球菌的分离鉴定[J]，山东畜牧兽医，2015,36（9）：10-11专利：1、一种用于快速检测水貂阿留申病病毒的双重PCR方法2、一种用于快速检测水貂病毒性肠炎病毒的双重PCR方法奖励：1、中期考核优秀2、校优秀毕业生3、动科院优秀研究生会干部46 山东农业大学全日制硕士专业学位论文8.致谢光阴似箭、时光如梭。转眼间，两年忙碌而充实的研究生学习即将结束。两年来，我不仅获得了专业领域的进步，也获得了同学之间的友情与老师之间的师生情。能顺利的完成课题的研究，离不开你们的帮助，在此对你们表示衷心的感谢！首先要感谢我的导师谢之景副教授，在我的研究生学习期间给我了莫大的帮助。无论是从开始的选题、期间的试验、最终的论文撰写都凝聚了您的心血。您对学生提出的问题总是不厌其烦的解答，并且能及时指出的问题，这对我试验、论文的顺利完成提供了很大的帮助。同时，您渊博的知识、耐心的指导、严谨的治学态度、爱岗敬业的精神都是我未来工作和生活中的榜样。再次感谢您两年来对我悉心教导！其次要感谢我的父母，感谢你们对我研究生两年学习的默默支持与鼓励，谢谢你们！衷心感谢山东农业大学预防兽医学专业的各位老师在我研究生学习期间给予的悉心指导和帮助，我将听从各位老师的各种宝贵建议，努力提高自己。衷心感谢师姐陈晨、宗晓晨、韩铠怿、蔺晓月，师兄李朋、刘存，同学赵永峰、刁非非、徐聪以及师妹韦雪华、王建莉，师弟刘传毅、郭守宇在我生活和学习中提供的帮助。感谢预防兽医系各实验室的同学对我的帮助。感谢我的父母及家人对我在外求学的无私奉献和支持。再次衷心感谢各位老师、同学和朋友的帮助和支持。47
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