猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

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猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定中国畜牧兽医2O11年第38卷第5期疾病防治?173?猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定隋慧,杨金生.(1.辽宁医学院畜牧兽医学院,辽宁锦州l21001;2.吉林省畜牧兽医科学研究院,吉林长春l30062)摘要:从辽宁某猪场采取病料,经处理后接种Marc～145细胞进行PRRSV分离,结果有2份病料在该细胞上盲传后可见典型的CPE,经测定其毒价为10jTCID/mI.间接免疫荧光试验可见黄色荧光,用电镜对纯化的病毒进行观察,可见有囊膜包裹的圆形病毒粒子,直径约为50～70nm.该病毒对氯仿,紫外线,酸碱度变化和热敏感.对有CPE的细胞培养物进行RT—PCR,结果为阳性.接种试验动物m现典型的PRRS临床症状和死亡.结果表明,成功分离到一株PRRSV.关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;分离;鉴定中图分类号:$852.65文献标识码:A文章编号:16717236(2011)05一O17304猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRs)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种接触性传染病.临床上以母猪流产,死产和产木乃伊胎等繁殖障碍以及哺乳仔猪高热,呼吸困难和高死亡率等为特征.本病于1987年首次在美国发现以来,各国相继发生流行性感染.目前已几乎传播到世界所有养猪国家,给世界养猪业造成严重经济损失.1991年Wensvoort等用猪收稿日期:20101028作者简介:隋慧(1978一),女,吉林人,讲师,硕士,研究方向:分子病毒学. 巨噬细胞(pulmonaryalveolarmacrophage,PAM)从发病猪群中分离到一株欧洲型PRRSV.1996年郭宝清等用PAM和Marc一145细胞首次从国内发病猪群中分离出PRRSV,随后中国的许多省都相继用肺泡巨噬细胞和Marc一145细胞分离到PRRSV毒株.近年来,中国大部分省份先后发生了高致病性PRRS疫情,对中国的养猪业造成了极大的危害和重大的经济损失.本试验从辽宁某猪场采集样品分离出一株疑似PRRSV,并对其进行初步鉴定.14MarkV.ScarrattK,KurtL,eta1.Bloodproteinsandinflarnmationinthehorse[J].VetClinEquine,2008,24:285～297.15MurataH,ShimadaN,YoshiokaM,eta1.Currentresearchona—cutephaseproteinsinveterinarydiagnosis:anoverview[J].The17VeterinaryJournal,2004,168(7):28～40.16SchmitzS,PfafflMW,BruckmaierRM,eta1.ShorttermthangesofmRNAexpressionofvariousinflammatoryfactorsandmilkproteinsinmammarytissueduringLPS-inducedmastitis[J].DomesticAnimalEndocrinology,2004,26:1l1～126.ViguierC,AroralS,GilmartinN,eta1.Mastitisdetection:currenttrendsandfutureperspectives[J].TrendsinBiotechnology,2009,27(8):487～489.TheEffectofGongyingPowerandAstragalustoAcutePhaseProteinsConcentrationsinSerumofRabbitswithExperimentalMastitisDENGHuaxue,ZHANGChuan—shi,YONGKang～,TANGHua—qiao,YANGDe—ying,YAoXue—ping.,SHENLiu—hong..CAOSui—zhong(1.DepartmentofAgricultureandBj.engineering,ChongqingThreeGorgesVocationalCollege,Chongqing404155,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Ya'an625014,China) Abstract:Toinvestigatetherelationofacutephaseprotein,mastitisandtheanti—mastitisdamagecapabilityofGongyingpowerandAstragalus,rabbitswhichwereinfusedwithLPStomodelmastitisweredividedintoGongyingpower,Astragalusandnegativecontrolgroup.RabbitswereoraladministratedwithGongyingpowerandAstragalustoevaluatetheconcentrations0fC—reactiveprotein,albuminandceruloplasmininserum.ThatGongyingpowerandAstragaluscouldreduceendotoxininducedacutephaseresponse.GongyingpowerandAstragalushavegoodeffectstomastitis.Keywords:rabbits;mastitis;Gongyingpower;Astragalus;acutephaseprotein?174?疾病防治中国畜牧兽医2011年第38卷第5期1材料与方法1.1材料1.1.1病料来源辽宁某猪场采集疑似PRRS病猪(流产胎儿),无菌采集的肺脏,肝脏,脾脏,淋巴结,血清等组织.1.1.2试剂犊牛血清为Hyclone产品.胰蛋白酶,MEM培养基为Gibco公司产品,LSTrizol试剂为Invitrogen公司产品,反转录酶AMVRT为大连TaKaRa公司产品,PFUDNA聚合酶为Promega公司产品.Marc一145细胞由吉林大学预防兽医学医学教研室保存.1.2方法1.2.1病毒的分离按殷震等(1997)介绍的方法处理病料,用无血清MEM将病料制成悬液,加双抗各200U(g)/mL,置4℃条件下4h后,冻融3次,3000r/min离心30rain.取上清液及血清病料,分别用0.22肛m微孔滤膜过滤.取滤液1mI,接种于 Marc一145细胞单层,培养4～5d.将培养物冻融3次,取冻融液1mI盲传,待出现典型CPE时收获病毒培养物,一2O℃保存.1.2.2间接荧光抗体试验按殷震等(1997)介绍的方法用Mare一145细胞制备6孔板进行.1.2.3病毒的电镜观察将分离毒冻融3次,超声裂解,进行非线性蔗糖密度梯度超速离心,用少量PBS悬浮沉淀.磷钨酸负染后电镜观察病毒形态.1.2.4病毒TCID.滴定取细胞培养病毒液,作10倍连续稀释,分别接种Marc～145细胞(96孔微量细胞培养板),每个稀释度接种8孔,每孔100肚L.置37℃,59/6CO:培养箱内培养,每天定时(2次)作好CPE情况记录.按Reed—Muench氏法计算TCID5o.1.2.5中和试验采用固定病毒一稀释血清法:按测定的TCID.将分离培养物作适当的稀释,并与10倍连续稀释的等量PRRSV标准阳性血清(稀释度为1O～10)混合,置37℃1h,再接种96孔细胞板,每个稀释度8孔,每孔100HL,同时设未加抗血清的对照.每天观察病变情况,96h后判定结果,计算血清中和指数.1.2.6理化测定病毒分离株对氯仿,紫外线,pH,热的敏感性试验参考殷震等(1997)介绍的方法进行.1.2.7RT—PCR鉴定1.2.7.1RT—PCR引物设计与合成根据引物设计原则,参照PRRSVCH—la株全基因组核苷酸序列设计1对可扩增PRRSVN基因的引物.上游引物为:5AATGGCCAGCCAGTCAATCA一3,下游 引物为:5～GGATCAGACGCACAGTATGA一3,由宝生物工程(大连)有限公司合成.1.2.7.2PRRSV感染细胞总RNA的制备及RT～PCR采用Trizol法制备PRRSV感染Mare-145细胞总RNA.反转录后进行PCR扩增.条件为98℃预变性5min;95℃变性30S,60℃退火45S,72℃延伸1rain,30个循环后,72℃延伸10rain.产物用10g/i琼脂糖凝胶电泳进行鉴定.1.2.8动物试验经检测PRRS阴性断奶仔猪12头,随机分成2组,每组6头,一组为试验组,另一组为对照组.将出现CPE的细胞培养物冻融3次离心取上清,接种试验组,每只2mL.对照组不接毒.每日观察临床症状并记录体温,14日后剖检观察病理变化.2结果2.1病毒分离培养用Marc一145细胞培养对送检病料进行病毒分离,结果病料在该细胞上盲传2～3代,培养72～96h后可见CPE.CPE表现为细胞有规律的先变圆,后皱缩,聚集,折光度降低,呈葡萄串状,继而灶性脱落,出现空洞(图1).AB图1分离病毒在Maer-145细胞上形成的CPE(400×)注:A,正常Macr一145细胞;B,Macr145细胞出现细胞病变.中国畜牧兽医2011年第38卷第5期疾病防治?175?2.2间接荧光抗体试验在荧光显微镜下,阳性血清出现明显特异性荧光(图2),而阴性血清和空白对照无荧光.图2PRRSV分离株IFA检测结果(400×)2.3病毒电镜观察进行复染电镜观察,可见病毒 略呈球形,大小以50～70nm为主(图3).图3电镜的病毒粒子(40000x)2.4TCIDj.滴定分离获得的培养物的TCID.为10?j/mL.2.5中和试验100TCID.的培养物可被PRRSV标准阳性血清所中和,中和效价为1:1361.2.6理化测定分离毒株经紫外线照射30rain后被灭活;氯仿(终浓度48mI/I)4C振荡15min后失活;经56C水浴45min后病毒完全失活;经pH5.0以下或pH7.5以上在4C的液体中作用2h后失活.结果表明,该分离到的病毒对紫外线,氯仿,热,酸碱敏感.2.7分离病毒的PCR鉴定对有CPE细胞培养物制备感染细胞总RNA进行RT—PCR,PCR产物经10g/I琼脂糖凝胶电泳鉴定,可见大小约为304bp的相应条带,与预期结果一致(图4).2.8动物试验试验动物接种后临床表现为2d后体温开始升高,最高达41.5℃.食欲不振,精神图4分离株的PCR鉴定注:1,PCR扩增条带;M,I)I2000DNAMarker.沉郁,呼吸困难,皮毛粗糙,耳,鼻端,肢端发绀.试验结束后,攻毒组4头死亡,对照组全部正常.试验组剖检肺脏弥散性黄褐色肝变,脾脏肿大,淋巴结肿大.分离血清可分离出PRRSV.以上试验结果证实所获得的分离培养物为PRRSV.3讨论自从猪繁殖与呼吸综合征于20世纪8O年代发生以来,该病已成为危害世界养猪业的重大疾病之 一,造成了严重的经济损失.中国于1995年始发此病(郭宝清等,1996),并迅速传播至全国各地,2006年高致病性的PRRS在江西暴发,随后蔓延至北京,河北,河南,湖南,广东等主要养猪省市,给中同养猪业带来了较大灾难.病毒分离是诊断PRRS最确切的一种方法,PRRS最早的确切诊断即是靠病毒分离完成的.研究结果表明,PRRSV培养的宿主细胞范围较窄,目前用于分离PRRSV的细胞主要有如下几种:猪原代肺泡巨噬细胞(PAM),CI2621细胞,CRI11171等细胞系,MA一1O4细胞系的克隆株Marc一145(刘伍海等,2008;Hanada等,2005).多数PRRSV毒株在PAM,Marc145等细胞上培养3～4d均可产生明显的CPE,但也有个别毒株在细胞上不m现CPE.Marc一145细胞可用于多种毒株的分离,其最高病毒滴度达10?TCID./0.1mL,接种后48h出现明显的CPE变化,细胞呈灶状变圆突起,72h后细胞皱缩,呈灶状脱落,接种4～5dCPE发展迅速,8O%～100细胞产生CPE变化.后来又从Marc一145细胞中克隆获得的HS2H细胞具有比Marc一145细胞更高的敏感性.虽然这些传代细胞?176?疾病防治中周畜牧兽医2011年第38卷第5期系能较好地代替PAM,但并不能支持所有分离物,特别是对欧洲型毒株.不同分离株在细胞培养上生长繁殖情况各不相同,有些病毒株在第一代细胞培养3～4d即可出现CPE,但有些毒株则需在第3代以后才出现CPE,有 些分离株在上述敏感细胞上并不出现细胞病变(Molitor等,l997).因此,在进行病毒分离的同时,对细胞培养分离的病毒还应结合相应的IFA等方法进行鉴定,也可用PCR法作遗传基因鉴定,从而使结果更为可靠(Bautista,1993).在本试验中,采用Marc一145细胞对送检病料进行病毒分离,结果病料在该细胞上盲传2～3代,培养72～96h后可见典型CPE.并进行IFA试验和电镜观察,在荧光显微镜下,阳性血清出现明显特异性荧光,电子显微镜观察,可见多数为5O～70nm的球形病毒粒子,这与国内相关报道相似(吴家强等,2002).在细胞出现典型的CPE后,取其感染物从中制备基因组RNA进行RT—PCR,结果与预期相符,从而实现了对所获得分离培养物进行快速,确切的鉴定.成功分离获得的辽宁分离株将为进一步开展辽宁省PRRSV感染机制及病原生物学相关研究奠定基础.参考文献1刘伍海,汪铭丰,程按春,等.PRRSV感染Marc-145细胞凋亡的形态学观察[J].黑龙江畜牧兽医,2008(3):61～63.2沈国顺,薛娜,王宇.猪繁殖与呼吸综合征病毒辽宁分离株ORF5基因的克隆与序列分析EJ].中国畜牧兽医,2010,8;52~54.3吴家强,颜世敢,胡北侠,等.细胞培养对PRRSVSD分离株滴度的影响EJ].山东农业科学,2002(6):41～42.4殷震,刘景华.动物病毒学[M].第2版.北京:科学出版社,l997.5郭宝清,陈章水,刘文兴,等.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究EJ].中国畜禽传染病,1996,18(2):l～4.6BautistaEM.SerologicsurveyforLelystadandVR～2332strainsofporcinerespiratoryandreproductivesyndrome(PRRS)virus., inUSswineherdsEJ].VetDiagnInvest,1993,5:612～614.7HanadaK,SuzukiY,NakancT.Theoriginandevolutionofpor—cinereproductiveandrespiratorysyndromeviruses[J].MolBiolandEvolut,2005(22):1024～1031.8MolitorTW,BautistaEM,ChoiCS.ImmunitytoPRRSV:doubleedgedsword[J].VetMierobiol,1997,55(1～4):265～276IsolationandIdentificationofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusSUIHui,YANGJin—sheng.(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,IiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,China;2.InstituteofAnimalHusbandyandVeterinaryScienceofJilin,Changehun130062,China)Abstract:Toisolateporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV),themorbidmaterialswerecollectedfromsomeswinefarmofIiaoningprovinceandinoculatedonMarc一145cellafterdisposa1.Afterblindtransferofculture,twoportionsshowedtypicalcytopathiceffect(CPE).TCIDj0ofviruswas10/mI.Bytheindirectimmunofluorescenceexperi—ment,theyellowgreenfluorescenceoccurredinthecellcytoblastema.Thevirusappearedtypicalporcinereproductiveandre—spiratorysyndromevirusform:diameterwasabout50—70nm,circlewithpeplosandpeplomer.Itwasinactivatedbychloro—form,ultraviolet,PHvariation,andheat.Thecel1cytoblastemawhichshowedCPEweretestedbyRTPCRshowedpositive.Thelaboratoryanimalsappearedobviousclinicalsymptomanddeathafterinoculation.TheresultshowedthatPRRSVwasi—dentifiedfromLiaoningprovince.Keywords:porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV);isolation;identification ;;l2008,2OO9年合订本(每册128l2002,2003年合订本(每册40元).l所《中国畜牧兽医》编辑部收.L,….,书讯…一];元),并有少量2004,2005年合订本(每册70元),1999,2000,2001,如有订购者,请汇款到:100193中国农业科学院北京畜牧兽医研究】…一……】…一一…,…,一一