资源描述：
《猪繁殖与呼吸综合征病毒5’非翻译区的结构与功能解析.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、猪繁殖与呼吸综合征病毒5’非翻译区的结构与功能解析本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus,PRRSV)5′非翻译区(5′Un-translatedRegion,5′UTR)为研究对象,PRRSV具有两种基因型:I型(欧洲型)和II型(北美型)。在本实验室拥有的PRRSV两型感染性克隆的基础上,对其5′UTR进行插入,缺失,替换等一系列的核苷酸突变,而改变该基因调控元件的一级序列、二级结构,从而寻找调控病毒感染性以及正常生物合成的顺式调控元件(Cis-acting
2、Element),为人工获得减毒活疫苗创造条件。现将研究内容简述如下:利用一级序列分析软件DNASTAR7.、1二级结构预测软件Mfold、RNAstructure5.0andViennaRNAfold对来自GenBank中的128株两型PRRSV基因组5′UTR序列进行分析。分析结果显示:第一,PRRSV两型5′UTR的一级核苷酸序列同源性只有40-50%,但存在四段高度保守区,其中包括已发现的转录调控序列(Transcription-regulatingSequence,TRS),此保守区为进一步研究PRRSV5′UTR提供了很好的切入点。第
3、二,PRRSV5′UTR二级结构在两型中高度保守,都具有6个茎环结构,并且最末端的一个高保守的茎环结构已证实为独立的顺式调控结构,为病毒不连续性转录(DiscontinuousTranscription)所必需结构。通过前述的二级结构分析,发现PRRSV基因组5′UTR中存在一个型间保守的茎环结构,命名为SL2,以2型PRRSV感染性克隆为平台进行反向遗传操作,使用突变PCR将N-SL2的一级核苷酸序列进行一系列突变、缺失、替换,以改变该结构的二级结构,从而解析该结构在病毒的复制过程中所发挥的影响。结果显示:PRRSV基因组5′UTR中的N-SL
4、2茎环结构为病毒亚基因组mRNA不连续性转录所必需,却不会影响病毒基因组RNA复制;另外证实该结构发挥作用的关键元件是其茎结构而非其“三核苷酸环结构”,并只有保持了该茎结构的完整性,才能保证病毒的复制及拯救。以PRRSV北美株感染性克隆为平台进行反向遗传操作,利用突变PCR将5′UTR中部分一级序列进行系列突变,以改变5′UTR二级结构中N-SL5的一保守茎部结构,从而解析PRRSV5′UTR中该结构与功能的关系。结果表明N-SL5的茎部结构其二级结构与病毒的拯救无直接关系,但其一级核苷酸序列却是PRRSV病毒复制所必需的,并找到直接调控病毒复制
5、的核心位点。由此证实了5′UTR中调控PRRSV复制过程的必需序列,为进一步解析PRRSV复制过程的调控元件奠定了基础。通过定点突变PCR技术将其5′UTR中一特殊高级调控元件N-SL5的一级序列进行突变,以改变其二级茎环结构,从而解析该结构的基因调控水平。结果表明,该高级调控元件的顶端环结构为病毒复制所必需,其可耐受2个核苷酸的突变;同时发现该调控元件中一保守的茎结构为病毒复制非必需。由此证实了PRRSV5′UTR中调控病毒复制过程的必需高级结构,为进一步解析PRRSV复制调控元件奠定基础。综上所述,本研究针对PRRSV5′UTR的一级序列及二
6、级结构进行解析,为进一步剖析PRRSV5′UTR的结构与功能的关系,及研发基因标识疫苗奠定了基础。析析析
