猪繁殖与呼吸综合征病毒N、GP5蛋白的表达、纯化及结构分析

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1、摘要猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。由PRRSV基因组ORF5、ORF7编码的GP5、N蛋白是其主要的结构蛋白。本研究通过构建PRRSVBJ一4株ORF5、ORF7不同的原核表达载体，应用不同的纯化方法。获得高纯度的重组表达蛋白，通过对纯化蛋白的圆二色谱(cD)分析，绘制出GP5、N蛋白的二级结构图，从结构生物学的角度分析了PRRSVN、GP5蛋白结构与功能的关系。分别应用pGEX-6P一1、pET28a表达载体，获得核衣壳蛋白

2、N的可溶性表达。将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)PRRSBJ-4株N基因克隆至原核表达载体pGEX-6P．1，重组质粒pGEX一6P-N在E,coliBL21细胞中可溶性表达融和蛋白GST-N，经GST亲和层析获得重组蛋白GST-N，应用PrescissionProtease切割获得纯化的N蛋白；将BJ-4株N基因克隆至原核表达载体pET28a，得到重组表达载体pET28-N．转化E．coliBL21(DE3)细胞，’获得可溶性表达，表达量占菌体蛋白的28％。经ProbandNi”亲和层析获得重组蛋白P

3、28-N。通过生物信息学分析，应用pGEx—6P-1、pET32a表达载体，分别构建了缺失信号肽的GP5蛋白及缺失跨膜域的t3P5突变体原核表达载体pGEX-6P-dE、pGEX-6P．dEM、pET32-dEM。表达量分别为16％，32％，50％。进一步通过包涵体变性复性、分子筛凝胶层析、GST亲和层析获得纯化的重组表达蛋白GST-dE、GST-dEM和P32．dEM。应用圆二色谱测定纯化的P28-N、GST-dE、GST-dEM等蛋白，计算相应的二级结构组成，结合生物信息学分析，绘制出GP5、N蛋白的二级

4、结构图。对P28-N重组蛋白的CD分析表明，P28-N中n螺旋、B折叠、T-转角、蜷曲分别为26．1％，23．7％，19．8％和30．3％：根据PDB中PRRSVVR2332株N蛋白c端部分三级结构，经同源模建绘制了BJ-4株相应域的三级结构；结合P28-N的结构预测，绘制出PRRSVN蛋白的=级结构图。N蛋白二级结构中，Ⅱ螺旋由40个∞组成。形成2条p链(12aa)，含有多处p转角(14aa)。圆二色谱对GST-dEM蛋白的分析表明，GST-dEM含有44％(155aa)的Ⅱ螺旋，14．4％的B链(约50a

5、a)。应用PDB中已解析的部分GST结构信息校正融合分子的结构；通过多种结构预测方法比较，确定共同保守域的二级结构；结合圆二色谱二级结构的检测结果，进一步绘制出PRRSVBJ．4GP5蛋白的二级结构图。GP5蛋白a螺旋约58n，B链约56fla，p转角14aa，其它为无规则蜷曲。根据N、GP5的二级结构，从结构的角度分析了PRRSVGP5、N蛋白结构与其功能的关系。N蛋白的二级结构与其参与病毒核衣壳的形成、NLS穿梭运转功能及其线性表位的形成等功能密切相关，N蛋白3个Ⅱ螺旋区及6链对N蛋白农壳的结构形成起重要

6、作用。通过对GP5二级结构的分析，为PRRSVGP5的变异、免疫原性、GP5的诱变表位等功能的认识提供了依据。关键词：PRRSV；N蛋白；GP5；二级结构；圆二色谱AbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)isthecausativeagentofPRRS。whichcausedreproductivefailureinSOWSandrespiratoryproblemsinpiglets．Glycosylatedmembranc

7、eprotein(GP5),nucleocapsid(N)proteincodedbyORF5，ORF7ofPRESV，a∞twomajorstructuralproteinsofPRRSV．Inthisstudy,theNproteinandGP5wereexpressedasafusionproteinwithglutathione—S-transferase(GST)orhis-taginEcoil,andtherecombinantproteinofNandGP5weresuccessfullypur

8、ifiedusingdifferentpurificationmethods．Subsequently,thesecondarystructureofNandGP5werecharacterizedbyciculardichroism(CD)spectroscopy,andtherelationshipsbetweenthestructureandfunctionofNorGP5wereanalyz