共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪γ-干扰素基因的腺病毒载体的构建与鉴定

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1、中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2007127(1)：35~40共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪Y-干扰素基因的腺病毒载体的构建与鉴定牛明福

2、李辦曹瑞兵

3、郑其升

4、魏建超

5、姫向吃李奇周記陈溥評•（1南京农业大学动物供学院农业部动物疫病诊斷和免疫歌点实验室南京2100952河南新乡医学院慕础医学院新乡453003）摘要利用PCR方法分别扩增猪繁殖与呼吸综合征病#全长GP5基因（编码E蛋白），EMCV的核糖体介入位点序列（IRES）及猪丫•干扰素基因全长序列（IFN乍），序列测定正确后用DNA重

6、组法将三者串联后插入PAdenoVatorCMV5-IRES-GFP穿梭质粒中，形成的穿梭质粒plRES-GP54FN-7用Pmel线性化后，与腺病毒骨架栽体pAdEasy-1共转化感受态大肠埃希氏茵BJ5183,经同源重组，构建成含有GP5基因和IFN-y基因的重组腺病#栽体,吟1酶切线性化充分暴露反向末端晝复序列后，脂质体转染HEK293A细胞，借助GFP的表达可以在转染后的2~3天观案到包装病*rAdeno-GP5-IFN-Y产生,7-10天出现病毒蚀斑。经PCR法及坯切证实各中间过程栽体及最终的包装病毒中携带有目

7、的基因，We*ern・blot证实两基因在腺病#中得到了表达。大肠杆茵内同源晝组法能有效和较为方便地构建出含有目的基因的腺病毒載体rAdeno4；P54FN-y,重组子能够在HEK293细胞中稳定扩增，病奉包装的成功为进一步研究PRRSVE蛋白的免疫效果及IFN乍的作用奠定了基础。关键词猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因猪十干扰素重组腺病毒中图分类号Q782•猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合症病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）引发的病毒性传

8、染病，病症主要表现为怀孕母猪早产、流产、木乃伊胎以及仔猪呼吸症状和髙死亡率（ll21o该病于1987年首先在美国爆发【31,1990年徳国亦发现此病，并迅速传播到欧洲其他国家。我国在1996年报道有该病流行⑷，由于该病的迅速蔓延使整个世界养猪业遭受了巨大的经济损失。PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毎，含有7个开放阅读框（openreadingframes,ORFs），其中，ORF5、6、7分别编码PRRSV主要的结构蛋白:糖基化囊膜蛋门（E）、膜蛋白（M）和核衣売蛋白（N）。囊膜蛋白（E）又称GP5蛋白,具有良好的抗

9、原性和免疫原性，分了址约25kDao研究表明GP5蛋白能刺激机体产生中和抗体，抗GP5抗体产牛在病猪恢复期，并且是针对PRRSV的主要中和抗收«HW：2006-06-07修回口期：2006-11-30•通讯作者■电了•俏箱:caimeihong^ujs.edu.cn体⑸,Ostrowski等6"报道从PRRSVcDNA噬菌体文库中筛选出PRRSV主要中和表位（Bepitope）并发现该中和表位存在于GP5外表位中部，研究者认为这对设计PRRSV基因工程疫苗很有帮助。由于针对PRRSV的传统疫苗如灭活苗或弱毒苗被证明存在

10、诸多缺陷⑻，开发廉价、安全、高效的基因工程疫苗已经成为当前的巫大课题°由于GP5蛋白在免疫学上的优良特性使其成为研制新型疫苗的首选。十干扰素是由滋活的T细胞和NK细胞产生的一种具有抗病莓和免疫调节功能的细胞因子⑼猪十干扰素（porcineinterferon-7,IFN）全基因为501个碱基，编码166个氨基酸【⑼。大址体内和体外试验表明，猪十干扰素对有垂大威胁的传染病病毒均具有防御和抑制作用，用IFN-/处理感染PRRSV的猪巨噬细胞，可抑制PRRSV增殖;用巫组IFN乍处理Marcl45细胞后，可抑制PRRSV野毒株

11、和细胞适应性朮株增殖⑴•⑵。在抗猪瘟病無36中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.27No.12007(CSFV)的细胞免疫中也发挥重要作用【⑶。腺病毒表达系统作为-种真核表达系统,已经广泛应用于很多基因的表达，待别是基因治疗方面。国外一些研究者已经用腺病毒成功表达了PRRSV的GP3、E和M蛋白。国内王海廉等党颖等〔⑻也分别用腺病毒载体构建口蹄疫病毒VP1基因和结核杆凿HSP70基因的重组腺病毒穿梭载体，王先炜等〔⑼利用重组腺病莓表达了猪圆环病毒IICap蛋白。针对PRRSV主要结构蛋白E蛋白和猪

12、的十干扰素，利用细繭内同源重组技术构建垂组腺病毒rAd-GP5-IFN-y,为进一步研究PRRSVE蛋白的免疫效果及IFNr在其中的作用打F了基础。1材料与方法1.1材料质粒PMD18T-ORF5系本室苏鑫铭博士将PRRSVNJv株ORF5全基因克隆入质粒PMD18-T中构建而成(No.：AY737282)；pGEM