猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体制备与鉴定.pdf

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1、Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterDevelopmentandCharacterizationofMonoclonalAntibodyagainstGP5ProteinofPorcineReproductionandRespiratorySyndromeVirusByZhihongWangSulAipingWan93upervlsor：WanlzZoologyDepartmentofBioengineeringMay2012原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是

2、本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：王基，哆】-日期：幻垃年孑月／日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手

3、段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：工土乃，日期：1。l珲‘只l段摘要摘要猪繁殖与呼吸综合征(PI潲)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种传染性疾病。PRRSV属于尼多病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。根据氨基酸序列差异，PRRSV可分为欧洲型和美洲型两个血清型。由于GP5在受体介导的病毒感染中扮演重要角色，并含有病毒蛋白主要的中和表位，所以制备GP5的单抗，具有重要的应用价值。本研究利用含重组表达质粒pET-GP5的大肠杆菌

4、EcoliBL21(DE3)，通过对诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度，诱导时间，诱导温度等一系列条件优化，最终确定在37oC，诱导剂(口TG)终浓度为O．6mM诱导6h条件下，PRRSV-GP5蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)qb以包涵体形式实现了高效表达。超声波裂解诱导表达菌体，用8mol／L尿素溶解包涵体，经镍螯合亲和层析纯化后，经SDS．PAGE分析表明成功获得了16kDa的变性PRRSV-GP5蛋白，Westernblot结果显示表达的GP5蛋白能与猪PRRSV阳性血清发生特异性反应。以重组表达的PRRSV-GP5蛋白作为检测抗原建立了筛选PRRSVGP5单

5、抗的间接ELISA检测方法。以纯化的重组GP5蛋白作为包被抗原，通过检测鼠阳性血清，以猪阳性血清作为竞争抗原，猪阴性血清作对照，筛选出阻断效果比较好的猪阳性血清作为阻断抗体，建立筛选单抗的阻断ELISA方法。通过摸索PRRSV感染细胞的不同时间，以及固定剂，固定时间，一抗和二抗稀释浓度和反应时间等，建立筛选单抗的间接免疫荧光法(IFA：Indirectimmunofluorescence)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA：Immtmoperoxidasemonolayerassays)。以纯化的重组GP5蛋白按常规方法免疫BALB／c小鼠，三免后效价达到l：6400。细胞

6、融合前3D，尾静脉注射GP5蛋白进行超强免疫。在筛选单抗时应用了阻断ELISA和间接免疫荧光相结合。按常规方法取免疫小鼠脾细胞与NS0细胞进行细胞融合，先利用GP5重组蛋白为检测抗原以间接ELISA进行抗体初筛获得58个阳性克隆(OD450>0．45)，再利用猪PRRSV阳性血清以阻断ELISA对阳性细胞克隆进行进一步抗体筛选，对强阳性细胞克隆进行3次有限稀释克隆化后，建立了3株稳定分泌抗GP5蛋白mAb的杂交瘤细胞株，分别命名为487、2C5和2FA。摘要间接ELISA测定细胞培养上清和腹水的效价，其中487的细胞培养上清和腹水的效价分别为1：800和1：51200，mA

7、b的Ig亚类均为IgGl。间接免疫荧光和免疫过氧化物酶单层试验结果显示，3株mAb均与感染PRRSVBJ-4株的Mare．145细胞特异性反应，表明其可识别PRRSV天然GP5蛋白的抗原表位。这些功能性单抗的成功制备，为PRRSV的免疫识别与快速检测研究提供了有效的技术手段。关键词：猪繁殖与呼吸综合征；GP5蛋白：阻断ELISA；间接免疫荧光；免疫过氧化物酶单层试验；单克隆抗体ⅡAbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndromeiscausedbyporcinerep