猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ4株GP5单克隆抗体的研制

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1、中国农业大学硕士学位论文猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株GP5单克隆抗体的研制姓名：姚建聪申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：杨汉春;郭鑫20040601中文摘要本研究用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重组GP5蛋白，成功制备出4株针对GP5蛋白的单克隆抗体，并对单克隆抗体的特性进行了鉴定和分析。GP5系列表位单克隆抗体的研制，有利于开展GP5抗原表位的定位分析。同时，结合oRF5的遗传演化分析，有利于阐明GP5在PRRSV感染中的免疫学功能。pGEX-4T-dORF5重组融合蛋白经亲和层析纯化后作为

2、免疫抗原免疫8周龄Balb／c小鼠，第一次免疫用抗原加等量弗氏完全佐剂背部皮下多点注射，然后两次用抗原加等量弗氏不完全佐剂同法免疫，免疫剂量为100．g／只。融合前三天做加强免疫，用不加佐剂抗原腹腔注射，剂量为100llg^日。获得免疫脾细胞，采用细胞融合技术与鼠源SP2／0骨髓瘤细胞进行融合。用部分纯化的pET32a-ORF5重组融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤，建立重组结构蛋白GP2间接ELISA方法，对重组GP5间接ELISA方法筛选出的阳性上清进行再次检测，淘汰假阳性孔。选择强阳性孔，采用

3、有限稀释法进行亚克隆，获得4株稳定分泌抗GP5单抗的杂交瘤细胞系，分别命名为B6A3、B6A4、F12F10和BllFllB2。经间接ELISA检测，结果表明B6A3和B6A4效价达到1：320000，F12F10和BIlFllB2效价在l：320000以上。对单抗进行亚类鉴定结果表明，所获得的4株单抗都为IgG2a疆类，轻链为K型。免疫印迹试验表明，单抗B6A3、F12F10能与重组GP5产生反应。制备PRRSV细胞培养单层，间接免疫荧光抗体试验表明，B6A3、F12F10能与全病毒反应，产生特异性荧光。选择B6A3在

4、HS．2H细胞系上进行病毒中和试验，结果表明该株单抗中和活性为可疑。把各株单抗分别作1：80000和1：160000稀释，B6A3和F12F10，B6A3和B11FIIB2，F12F10和BIlFlIB2混合进行间接ELISA检测时，OD450nm值比其中任何一种单抗单独测定时的OD450nm值高。推测，B6A3和F12F10。B6A3和B1IFllB2，F12F10和B11F1182可能识别不同的抗原表位。关键词；猪繁殖与呼吸综合征病毒，GP5，单克隆抗体AbstractInthisstudy，fourstablehy

5、bridomaeelllinesthatproducedmonoelonalantibodiesspecificforPRRSVGP5wereestablishedwithchromatograpby-purifiedrecombinantGP5，thepmpe舳ofthesefourmAbswerecharacterizedandanalysized．TheBalb／CmicewereimmunizedsubcutaneouslyontheneckandthebackwithlOOpgpurifiedrecombina

6、ntGP5mixedwithcompleteFretmd’SadjuvantandtheothertwoimmunizationswiththesameamountofantigenmixedwithimcompleteFretmd'sadjuvantattwoweeksinterval．Theedaysbeforecellfusionwasperformed，miceWereboostedwithlOOltgantigenintrapedtoneally．ImmunizedsplenocytesWerecollecte

7、dandfusedwithmyelomacelllineSP2／0,whichWOreinthelogarithmicphasoofgrowth．AnindirectELISAwasestablishedtoscreenthehybfidomasforproductionofspecificantibodiesinthecellculturemedium，inwhichthepartiallypurifiedrecombinantproteinpET32a-dORF5wasused笛coatingantigen．Mean

8、while．theindirectELISAbasedonG洲0RF2wereestablishedtoruleoutthefalsepositives．Totally12hybridomaswithhighELISAtitreswereselectedandsubelpnedbyalimiting-dilution